혈관내피세포(ECV304 cell)에서 녹차가 식이성 지질 과산화물에 의한 진행성 동맥경화에 미치는 영향

Abstract

최근 우리의 식생활이 서구화 되어감에 따라 식이 지방의 섭취가 증가하였으며, 이로 인해 심장 및 뇌혈관 질환의 발병률이 증가하고 있다. 식이 지방의 섭취량뿐만 아니라 체내에서 생성되는 지질 과산화물을 심혈관 질환의 원인물질로 제시하는 연구가 보고되고 있다. 생체 내에서 최종적으로 생성되는 지질 과산화물의 한 형태인 4-HNE(4-hydroxynonenal)는 ω-3계열과 ω-6계열 지방산이 함유된 지질의 과산화 과정에서 생성된다. 이렇게 형성된 지질 과산화물들은 혈관벽의 산화적 손상을 유발하여 혈관성 세포사멸을 초래하고, 이는 생리적인 기능장애뿐만 아니라 동맥경화와 같은 심혈관 질환을 유발시킨다고 보고되고 있다. 세포사멸(apoptosis)이란 개체를 구성하고 있는 세포가 조직의 항상성을 유지하기 위하여 능동적으로 죽는 적극적인 현상으로, 프로그램화된 세포사멸(programmed cell death)이라고도 한다. 그러나 세포사멸은 퇴행성 질환의 원인이 되고 면역질환 등을 유발한다고 알려져 있으며, 이러한 질환은 산화적 스트레스와 연관되어 있다고 보고되고 있다. 산화적 스트레스는 미토콘드리아 관련성 세포사멸 경로를 통해 세포사멸을 유발한다. 미토콘드리아 관련성 세포사멸 경로에 관여하는 단백질에는 cytochrome c, bcl-2, caspase-9, caspase-3 등이 있다. 최종적으로 활성화된 caspase-3는 PARP[poly(ADP-ribose)polymerase]를 활성화시켜 DNA 분절화 현상과 핵의 응축을 유도하면서 세포사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이러한 산화적 스트레스에 의하여 유발되는 세포사멸을 억제하는 물질로는 녹차, 콩류, 포도, 마늘 및 양파류 등의 채소나 과일에 존재하는 폴리페놀 성분들이 제시되고 있다. 특히 녹차에 함유된 폴리페놀 성분들은 지질의 과산화 현상을 억제하여 심혈관계 질환의 발병률을 감소시킨다고 보고되고 있으며, 과산화물과 지질 라디칼을 효율적으로 제거하여 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 항산화 기전에 관여하는 효소의 활성을 증가시킴으로써 과산화 물질을 제거하고, 산화적 스트레스에 의한 세포사멸 기전을 억제한다고 보고되고 있다. 따라서 본 연구는 인체 혈관 내피 세포(ECV304 cell)를 이용하여 4-HNE가 혈관 내피 세포의 사멸에 미치는 영향과 이에 따른 녹차의 생리활성 효과를 살펴보기 위하여 4-HNE는 50, 100, 200, 400 μM의 농도로 처치하였고, 녹차 에탄올 추출물(green tea ethanol extracts, GTE)은 10, 20 ㎍/㎖의 농도로 처치하여 세포 생존율을 측정하였다. 위의 실험 결과를 바탕으로 4-HNE 50 μM과 GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치하여 세포의 형태학적 변화, 지질 과산화물(lipid peroxides, LPO)의 함량, caspase-3 단백질의 활성도, 미토콘드리아 관련성 세포사멸 경로에 관여하는 단백질의 발현정도를 측정하였으며, 실험 결과는 다음과 같다. 1. 세포의 형태학적 변화를 살펴보면, 4-HNE 50 μM 처치군은 배양시간이 지남에 따라 세포사멸 현상이 뚜렷하게 나타났다. 반면, GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치한 군에서는 1, 6시간 배양 시 4-HNE 50 μM 처치군에 비해 세포사멸 현상이 감소하는 것으로 관찰되었다. 그러나 12, 24시간 배양 시에는 GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치한 군에서 세포사멸 억제효과가 나타나지 않는 것으로 관찰되었다. 2. 4-HNE를 50-400 μM의 농도로 처치하여 12, 24, 48시간 배양 후 세포생존율을 관찰한 결과 농도 의존적이며 배양시간 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 또한 4-HNE를 50 μM의 농도로 처치한 후 1, 3, 6, 12, 24시간 배양하였을 경우에도 같은 경향을 나타내었다. 반면, GTE 10, 20 ㎍/㎖를 4-HNE 50 μM과 함께 처치하여 1, 3, 6, 12, 24시간 배양하였을 경우에는 4-HNE 50 μM 처치군에 비해 세포 생존율이 증가하는 것으로 관찰되었다. 특히 GTE 20 ㎍/㎖를 처치하였을 경우에는 GTE 10 ㎍/㎖를 처치한 것에 비해 세포 생존율이 더 높은 것으로 나타났다. 3. 지질 과산화물 함량에 있어서는 4-HNE 50 μM을 처치하였을 경우 대조군에 비해 지질 과산화물 함량이 시간 의존적으로 증가하였다. 반면, GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치한 군에서는 1, 6시간 배양 시 지질 과산화물의 함량이 유의적으로 감소하였다(p=0.009, p=0.024). 그러나 12, 24시간 배양 시에는 GTE 20 ㎍/㎖의 첨가가 지질 과산화물 함량에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 4. caspase-3 활성도를 살펴보면 4-HNE 50 μM 처치군에서는 배양시간이 증가할수록 caspase-3의 활성이 유의적으로 증가하였다(p<0.001). 반면, GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치한 군에서는 4-HNE 50 μM 처치군에 비해 1, 6시간 배양 시 caspase-3의 활성도가 유의적으로 감소하였다(p=0.001, p=0.002). 12시간 배양 시에도 caspase-3의 활성도가 감소하였으나 유의적이지 않았으며, 24시간 배양 시에는 caspase-3의 활성도가 4-HNE 50 μM 처치군에 비해 다소 증가하였으나 유의적이지 않았다. 5. cytochrome c 단백질의 발현정도는 4-HNE 50 μM 처치군의 경우 모든 배양시간에서 cytochrome c 단백질의 발현이 증가한 것으로 나타났다. 반면, GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치한 군에서는 1, 6시간 배양 시 4-HNE 50 μM 처치군에 비해 cytochrome c 단백질의 발현이 억제되었다. 그러나 12, 24시간 배양 시에는 GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치한 군에서 cytochrome c 단백질 발현에 대한 억제효과가 관찰되지 않았다. 6. 항세포사멸 인자인 bcl-2 단백질의 발현정도를 살펴보면, 4-HNE 50 μM 처치군은 대조군과 비교하였을 경우 bcl-2 단백질의 발현정도가 유사한 것으로 관찰되었다. 반면, GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치한 군에서는 1, 6시간 배양하였을 경우 bcl-2 단백질의 발현이 4-HNE 50 μM 처치군에 비해 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 12, 24시간 배양하였을 경우에는 bcl-2 단백질의 발현정도가 4-HNE 50 μM 처치군과 유사한 것으로 나타났다. 7. caspase-3 단백질의 발현정도는 4-HNE 50 μM 처치군의 경우 모든 배양시간에서 활성화된 caspase-3 단백질의 발현이 증가한 것으로 나타났다. GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치한 군에서는 1, 6시간 배양하였을 경우 4-HNE 50 μM 처치군에 비해 활성화된 caspase-3 단백질 발현이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 12, 24시간 배양 시에는 GTE 20 ㎍/㎖를 함께 처치한 군에서 활성화된 caspase-3 단백질 발현에 대한 억제효과가 관찰되지 않았다. 이는 GTE가 초기 배양시간에서 세포사멸을 억제하는 역할을 한 것으로 사료된다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 지질의 과산화 생성물질인 4-HNE는 인체 혈관 내피 세포(ECV 304 cell)에서 미토콘드리아 관련성 세포사멸 경로를 통해 세포사멸을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 녹차 에탄올 추출물은 6시간 이내의 초기 배양시간에서 4-HNE에 의하여 유도되는 세포사멸을 억제하였다. 이와 같은 혈관 내피 세포에서 녹차의 세포사멸 억제효과는 동맥경화의 예방에 도움을 줄 것으로 기대된다. 향후 연구로서 세포 신호 전달 체계의 초기과정에 있어서 녹차와 관련된 기전적 연구가 요구되어지며, 이를 바탕으로 녹차에 함유된 폴리페놀 성분들의 임상적인 활용 가능성을 타진할 필요가 있겠다.|It has been reported that lesions on endothelial cells are proposed to be the initial event in the development of atherosclerosis. Reactive oxygen species or metabolic oxides is believed to be one of contributing factors in the several diseases including the vascular disease and aging process. 4-hydroxynonenal (4-HNE), one of dietary lipid peroxides, can be produced by oxidative stimuli and has been suggested to mediate a number of oxidative stress-linked pathological incidences, including cellular growth inhibition and apoptosis. There is growing evidence that natural polyphenols could prove useful in the prevention of pro-oxidative states mediated by formation of free radicals species in different pathological situations. Flavonoids, commonly known as catechins, are major polyphenolic components of green tea, black tea, red wines and fruits. Green tea contains relative large amounts of antioxidant polyphenols such as (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) and epigallocatechin (EGC). These compounds have much attention because of their antimutagenic and anticarcinogenic effects. Therefore, the purpose of this study is to investigate that bioregulation of green tea ethanol extracts (GTE) containing polyphenols on the 4-HNE induced apoptosis in ECV304 cells. ECV304 cells were cultured in DMEM media treated with 50-200 μM 4-HNE and 10-20 ㎍/㎖ of GTE. After cells were incubated for 1-24 hours, cell viability and morphology were measured. Also the levels of lipid peroxides (LPO), caspase-3 activity were measured and analyzed by western blot of cytochrome c, bcl-2, and caspase-3 proteins. The results of this study were as following; 1. 4-HNE was time- and dose-dependent apoptotic effects on the endothelial cell death. On the other hand, GTE (10-20㎍/㎖) was dose-dependent anti-apoptotic effects as evidenced by changes in cell morphology and cell viability in 4-HNE induced apoptosis of ECV304 cells. 2. 4-HNE 50 μM time-dependently increased the LPO production in ECV304 cell, whereas GTE 20 ㎍/㎖ significantly reduced the 4-HNE induced LPO production within 6 hour incubation. But GTE was no effect after 6 hour incubation on the content of LPO. 3. To confirm that GTE has anti-apoptotic effect, ECV304 cells were treated with either 4-HNE 50 μM or 4-HNE 50 μM together with GTE 20 ㎍/㎖. GTE 20 ㎍/㎖ inhibited caspase-3 activity until 6 hour compared to 4-HNE 50 μM. 4. Western blot analysis showed that treatment of 4-HNE-exposed cells with GTE inhibited the releasing of cytochrome c from the mitochondria to cytosol until 6 hour incubation. The caspase-3 expression also, was blocked by a treatment with 20 ㎍/㎖ of GTE until 6 hour incubation. Treatment of 4-HNE-exposed cells with GTE enhanced the bcl-2 expression within 6 hour incubation. It is considered that GTE may switch off the apoptotic death cascade by increasing the activation of bcl-2 and likely by boosting the intrinsic cellular tolerance against apoptotic triggers. In conclusion, green tea ethanol extracts (GTE) has function as an anti-apoptotic agent in 4-HNE induced apoptosis of ECV304 cells. Since the polyphenols in GTE were effective in preventing endothelial apoptosis by oxidative stress such as 4-HNE, this study suggests that natural polyphenols might be anti-atherosclerotic chemicals in future.