은행나무(Gingko biloba L.)잎 추출물의 일부 식중독균에 대한 항균효과

Abstract

본 연구는 천연 항균 소재를 탐색하기 위한 목적으로 국내에 자생하는 은행나무(Gingko biloba L.) 잎의 methanol 추출물을 용매별로 순차분획하여 4종의 식품 유해 미생물(Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes)에 대한 항균활성을 paper disc법으로 살펴보았으며, 그 추출물과 재추출물의 최소저해 농도(Minimum inhibitory concentration, MIC), 생육곡선, 24시간에서의 생육저해율, 페놀성 화합물의 함량 측정, 열과 pH에 대한 안정성을 확인하였다. 나아가 현재 시판되는 주방 세제에의 첨가 효과를 살펴보았다. 한편 항균성 물질을 분리하기 위해 항균성이 높았던 butanol 재추출물을 선택하여 silica gel column chromatography, thin layer chromatography(TLC)를 실시하였으며, 이상의 실험들을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 은행나무 잎의 methanol 추출물의 수율은 24.35 %이었다. 용매별 재추출물의 수율은 water 재추출물, chloroform 재추출물, butanol 재추출물이 각각 40.19%, 18.21%, 16.05%였다. 반면, n-hexane 재추출물과 ethylacetate 재추출물은 각각 8.6%, 4.64%로 10% 미만의 수율을 나타내었다. 2. Paper disc 법을 사용하여 조사한 용매별 항균효과는 methanol 추출물이 4종의 시험균주 모두에서 약 7.5mm로 비슷한 항균효과를 나타내었다. Ethylacetate 재추출물과 butanol 재추출물, water 재추출물은 E.coli에 대하여 9mm의 강한 항균효과를 나타내었고, S. typhimurium에 대하여는 8mm의 항균효과를 보였다. 3. Broth microdilution 법을 시행하여 균의 최소저해 농도(MIC)를 측정한 결과에서 butanol 재추출물의 항균활성이 E. coli와 S. typhimurium, L. monocytogens에 대하여 62.5㎍/ml, S. aureus에 대하여는 32.15㎍/ml로 상당히 낮은 MIC 값을 나타내었다. 4. 은행나무 잎 methanol 추출물과 용매별 재추출물을 농도별로 처리한 균들의 생육도를 균주별로 조사한 결과, 4종의 균주에 대하여 methanol 추출물과 ethylacetate 재추출물, butanol 재추출물이 첨가농도에 따라 항균효과가 상승하였다. 특히 ethylacetate 재추출물에서는 첨가된 농도 모두에서의 항균효과가 배양 48시간까지 지속되었다. 5. 24시간에서의 생육 저해율을 확인한 결과, methanol 추출물은 모든 균에 대하여 20%이상의 높은 생육 저해 ?염倖? 나타내었고 특히 S. aureus에 대하여는 60%이상의 높은 저해율을 나타내었다. 재추출물 중에서는 butanol 재추출물에서 E. coli, S. typhimurium, L. monocytogenes에 대하여 50%이상의 생육저해를 나타내었다. Ethylacetate 재추출물에서는 4종의 균주 모두에 대해, water 재추출물은 S. aureus를 제외한 3종의 균주에 대해 20%이상의 생육저해를 나타내었다. n-Hexane 재추출물은 E. coli에 대해 74%의 생육저해를 보였고, S. aureus에 대해서는 100%이상의 강력한 생육저해를 보였다. Chloroform 재추출물에서도 S. aureus에 대해서 88%의 높은 저해율을 보였다. 6. 은행나무 잎 추출물과 재추출물에 대한 페놀성 화합물의 함량에 대하여 검토한 결과 butanol 재추출물의 페놀성 화합물의 함량이 methanol 추출물의 2배 이상이 되었다. Ethylacetate 재추출물에서도 이와 유사한 페놀성 화합물 값을 나타내었고, methanol 추출물, water 재추출물, n-hexane 재추출물, chloroform 재추출물 순으로 페놀성 화합물 함량이 감소하였다. 7. 은행나무 잎의 methanol 추출물과 butanol 재추출물의 농도를 1 mg/disc로 하여 40, 80, 100, 120℃에서 각각 1시간 동안 열처리 한 후 S. typhimurium의 생육정도를 측정한 결과, 모든 처리구에서 대조구와 차이가 없는 항균활성을 보였는데, 특히 120℃의 처리에 의해서도 methanol 추출물에서 항균활성이 있는 것으로 나타나 열에 매우 안정한 물질임을 알 수 있었다. 8. 은행나무 잎의 pH 변화에 대한 항균력의 안정성을 조사하기 위하여 methanol 추출물과 butanol 재추출물의 농도를 1 mg/disc로 하여 pH를 2, 5, 7, 9, 11로 조절한 후 S. aureus의 생육정도를 조사한 결과 methanol 추출물은 모든 pH 조건에 대하여 대조구와 비교시 항균활성에 있어 차이가 나타나지 않아 pH 안정성이 매우 우수함을 알 수 있었고, butanol 재추출물은 산성에 대해서는 안정한 반면, 강알칼리쪽으로 갈수록 활성이 낮아지는 경향을 나타내었다. 9. 시판 주방용 세제에 methanol 추출물을 농도별로 첨가하여 4종의 균주에 대한 항균효과를 확인한 결과 특히 E. coli에 대하여 항균효과가 우수하였다. 즉, 500ppm의 추출물을 첨가한 군이 세제만 첨가한 군에 비해 약 16.15%, 1500ppm의 추출물을 첨가한 군은 0.08%(1.0×10^(1)CFU/ml)의 균수만이 잔존하였다. S. aureus에 대해서는 세제만을 첨가한 군에 비해 500ppm 첨가군에서 약 49%, 1000ppm 첨가군에서 약 34%, 1500ppm 첨가군에서 약 0.12%의 균수만이 잔존하였다. S. typhimurium에 대하여는 세제만을 첨가한 군에 비해 500ppm 첨가군이 약 83%, 1000ppm 첨가군이 약 58%, 1500ppm 첨가군이 약 20%의 잔존률을 보였다. L. monocytogens에 대해서는 1500ppm의 추출물을 첨가한 군이 세제만을 첨가한 군에 비해 5.29%의 균수만이 잔존하여 뚜렷한 항균효과를 나타내었다. 10. 항균활성이 강한 재추출물로부터 유효성분을 검색할 목적으로 butanol 재추출물을 silica gel column chromatography를 행하여 118개의 분획을 얻어 항균력을 측정한 결과 대체로 49~60번의 분획이 4종의 균주에 대해 증가된 항균활성을 보였다. 11. silica gel column chromatography를 행하여 항균활성이 크게 나타난 분획물들의 TLC chromatogram을 얻었다. Rf 0.53에서 공통적인 물질군이 나타나고 있으나 항균활성이 강했던 분획 49~60번 부근에서 Rf 0.38의 물질군이 나타나 이 물질이 주 항균성 물질로 생각되었다. 이상의 결과로서 은행나무(Gingko biloba L.) 잎은 항균활성물질을 갖고 있고, 특히 butanol 재추출물이 4종의 균주에 대해 항균활성이 가장 컸으며, 또한 열과 pH에 안정하여 다양한 가공적성에 이용될 수 있고, 시판 세제의 항균성 상승 효과를 확인함으로써 항균 소재로서의 이용 가능성이 높음을 암시하였다. 한편 항균활성물질을 분리하기 위해 용매순차분획, silica gel, TLC를 실시하여 증가된 항균활성을 확인하였고, 차후 항균물질을 동정하고 안전성을 확인하여 은행나무 잎을 천연 항균 소재로 개발할 가치가 충분히 있다고 하겠다.|The substances from the methanol extract of leaves of Gingko biloba L, the plant grows naturally in Korea, have been fractionatedby four solvents according to polarities in order to investigate antimicrobial compounds in nature. Antimicrobial effects against four microorganisms (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, and Listeria monocytogenes) were measured by paper disc method. Furthermore, minimum inhibitory concentrations (MIC) growth inhibition curve, 24 hour - inhibitory effect rate, phenol compound contents, and heat & pH safety analyses have been performed. Synergistic effect was identified by adding extract of kitchen detergent sold at a market. In order to purify antimicrobial substances from the butanol fraction, which exhibited a strong antimicrobial activity, silica gel column chromatography, thin layer chromatography(TLC) were applied. The following results were obtained 1. The yield ratio of methanol of Gingko biloba L. leaves extact was 24.35%. The yield ratios of Water, chloroform,and butanol fractions were 40.19%, 18.21%, and16.05% respectively. However n-hexane fraction and ethylacetate fraction were taken in the ratio of less than 10.00%. 2. Using paper disc method, the methanol extract showed an antimicrobial effect against all test microorganisms(7.5mm). Ethylacetate fraction, butanol fraction ,and water fraction showed a strong antimicrobial effect against E. coli(9mm) and S. typhimurium(8mm). 3. MICs of microorganisms obtained by broth micro-dilution method were 62.5㎍/ml for E. coli, S. typhimurium, and L. monocytogens and 31.15㎍/ml for S. aureus. The lowest value indicated that the substance could exhibit antimicrobial activity at the low level concentration. 4. Inhibitions for all species grown in the medium with various fractions of Gingko biloba L. leaves extract increased proportionally to the concentration of extract solutions. In addition, the antimicrobial effects lasted for at least 48 hours for all species. 5. The results of identifying antimicrobial inhibitory effect rates showed that methanol extract had more than 20%, especially 60% of inhibitory effect against S. aureus. Butanol fraction was obtained, and high inhibitory effect rates of more than 50% against E. coli, S. typhimurium and L. monocytogenes. Ethylacetate had an inhibitory effect rate more than 20% against all microorganism and water fraction had more than 20% except S. aureus. n-Hexane fraction had 74% against E. coli and more than 100% against S. aureus. Chloroform fraction had 88% against S. aureus. 6. At the result of phenol compound contents of Gingko biloba L., butanol fraction was more than twice as much asmethanol extract. Moreover, the value for ethylacetate was similar to that of butanol fraction. According to water fraction, methanol extract, chloroform fraction and n-hexane fraction decreased the phenolic compound contents. 7. After heat treatment to the methanol extract and butanol fraction at 40, 80, 100, and 120? for an hour, growth ratesof S. typhimurium were measured for each case. According to the result of growth rates, there was no difference in antimicrobial activity on all tests and controls. Especially, methanol extract treated with heat at 120? had antimicrobial activity, which means that methanol extract is a very stable substance with heat. 8. In result of growth of S. aureus in the medium adding the methanol extract treated with various pH conditions(2, 5, 7, 9, 11), there was no difference in antimicrobial activity. Therefore, its stability on pH was high quality. While butanol fraction was stable against acid, the more alkali side was the lower activity. 9. The number of survival microorganisms was counted as an antimicrobial effect against S. aureus for kitchen detergent, added with the methanol extract at various concentrations. Especially, antimicrobial effect against E. coli was superior to the others. The extract of 500 ppm, 1500pm had 16.15%, 0.08% of microorganism of the detergent, respectively. Against S. aureus, the extract of 500 ppm, 1000ppm, and1500pm had 49%, 34%, and 0.12% of microorganism of the detergent, respectively. Against S. typhimurium, the extract of 500 ppm, 1000ppm, and 1500pm had 83%, 58%, and 20% of microorganism of the detergent respectively. Against L. monocytogenes, the extract of 1500pm had5.29% of microorganism of the detergent. 10. In order to isolate antimicrobial substance,the butanol fraction which exhibited a strong antimicrobial activity was purified by silica gel column chromatography. The antimicrobial effect for 4 microorganisms of the 49~60 subfractions among the obtained 118 fraction was increase against butanol fraction. 11. The 49~60 subfractions that increased antimicrobial effect by silica gel column chromatography isolated by TLC. The Rf value of 0.38 was regarded the antimicrobial substances. As results, Gingko biloba L. leaves contain antimicrobial activity components, and it showed the strongest antimicrobial effect upon the butanol fraction. Since it was stable with changing temperature and pH, it implied that it could be used for process property widely as a broad spectum. Using normal detergents, it was confirmed that Gingko biloba L. leaves extract exhibit antimicrobial synergistic effect, and the results suggested thatit is highly applicable to use as an antimicrobial material. In order to isolate and purifyantimicrobial substances, solvent fractionation, silica gel column chromatography, TLC analysis techniques were applied. Also, Gingko biloba L. growing naturally in Korea is invaluable to develop as a natural antimicrobial material after isolation and identification.