식이 불포화지방산의 종류에 따른 지질 과산화물 생성이 혈관내피세포의 apoptosis에 미치는 영향

Abstract

영문초록: p. 61-62|최근 발병하는 심장 및 뇌혈관계 질환의 원인으로 가족력, 비만, 음주, 흡연, 남성, 폐경, 나이, 혈중 지질농도, 혈중 호모시스테인 농도의 증가, 유전자 다형성과 같은 많은 요인들 중 특히 식이 지방산의 섭취로 인한 발병률이 증가하고 있다. 식이 지방산은 종류와 양에 따라 세포막 조성에 미치는 영향이 다르고 과산화물 생성에도 차이를 보인다. 이 중 DHA(Docosahexaenoic acid)와 EPA(Eicosapen-taenoic acid) 등과 같은 ω-3계의 고도 불포화지방산(polyunsatu-rated fatty acids, PUFA)들은 산화적 스트레스로 인해 다량의 과산화물을 생성하고 결국은 혈관 내피 세포의 손상을 초래한다. 신체를 구성하고 있는 기본단위인 세포는 조직의 항상성을 유지하기 위하여 세포의 분열과 사멸을 조절한다. 세포의 능동적인 죽음을 자가 사멸(apoptosis) 또는 프로그램 세포사멸이라고 한다. 이 자가 사멸 과정에 관여하는 caspase는 세포 사멸시 활성화되는 중요한 단백질 분해효소이고, cystein protease의 일부인 caspase-3 는 세포질에 존재하는 DNase를 활성화시켜 핵 내로 이동시킴으로써 DNA의 분절을 초래하여 자가 사멸을 유도하는 중심적인 역할을 담당한다. 그러므로, 본 연구는 인체에서 유래한 혈관 내피 세포(ECV304)에 식이성 불포화지방산인 linoleic acid(LA), docosahexaenoic acid(DHA), arachidonic acid(AA)를 각각 100uM로 처치한 후 ① 세포의 독성 ② 세포의 형태학적 변화 ③ 세포막의 지방산 유입률 ④ 지질 과산화물의 생성 ⑤ caspase-3의 활성도 등을 분석하여 지방산의 종류에 따른 ECV304 세포의 자가 사멸을 측정하였다. 또한 ECV304 세포에서 식이성 불포화 지방산의 유입에 의해 생성되는 지질 과산화물인 4-HNE+MDA (4-hydroxynonenal+malondialdehyde), 4-HNE 및 MDA를 각각 50uM로 처치한 것과 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 세포독성은 지방산을 처치 후 12, 24, 48시간 배양한 결과 DHA 처치군이 LA와 AA 처치군 보다 세포 사망률이 높게 나타났다. 2) 세포의 형태학적 변화는 LA 및 AA 처치군에 비해 DHA 처치군의 변화가 가장 크게 나타났다. 지질 과산화물 중에서 4-HNE 처치군의 세포 형태는 MDA 처치군에 비해 변화가 크게 나타났고, DHA 처치군과 유사한 양상을 나타냈다. 3) 세포내 지방산의 조성 변화는 다음과 같다. 각각의 처치한 지방산은 세포내 유입이 잘 이루어졌고 유입률은 배양시간에 따라 차이를 나타내었다. 12시간 배양한 DHA 처치군과 24시간 배양한 LA 처치군의 지방산 유입률이 가장 높았다. 또한 처치한 지방산의 종류에 따라 P/S 비율과 ω-3/ω-6 비율이 변하였다. 즉, LA 처치군은 DHA 처치군에 비해서 P/S 비율이 높았고 ω-3/ω-6 비율은 낮았다. 4) 지질 과산화물(4-HNE+MDA)은 생성은 LA 및 AA 처치군에서 대조군에 비해 차이가 없었으나 DHA 처치군은 대조군에 비해 10배 증가되었다. 결과적으로 ω-3 지방산이 ω-6 지방산 보다 또는 불포화도가 높은 지방산이 낮은 지방산 보다과산화물의 생성이 증가되는 것을 보여주었다. 5) 지질 과산화물에 의한 세포 사망률을 조사한 결과는 다음과 같다. 4-HNE와 MDA를 1:1로 혼합한 50uM, 100uM ,200uM의 4-HNE+MDA를 ECV304 세포에 처치한 결과 대조군에 비해 세포 사망률이 유의적으로 증가하였다. 같은 결과로 50uM, 100uM, 200uM의 4-HNE를 ECV304 세포에 처치한 결과도 대조군에 비해 세포사망률이 유의적으로 증가하였다. 반면 50uM, 100uM, 200uM 의 MDA 처치군의 세포 사망률은 대조군에 비해 농도나 시간에 의존적이지 않았다. 그러므로 지질 과산화물의 대부분을 MDA가 차지하고 있다고 하더라도 직접적인 세포사멸은 4-HNE에 의해 유도된다고 볼 수 있다. 6) 세포내 처치한 지방산의 유입으로 생성된 지질 과산화물이 세포 사멸에 미치는 영향을 연구하기 위해 caspase-3 활성도를 측정하였다. LA, DHA, AA 처치군은 배양시간이 증가할수록 caspase-3 활성도가 증가하였다. 특히 DHA 처치군은 다른 군에 비해 caspase-3 활성도가 1.5~3배 정도 높았다. 한편 4-HNE 처치군은 모든 시간대에서 MDA 처치군보다 caspase-3 활성도가 높았고, MDA 처치군은 LA, DHA, AA 처치군에 비해 활성도가 낮았다. 그러므로 지방산의 caspase-3 활성도의 증가는 지질 최종 과산화물 중 MDA 보다는 4-HNE에 의한 것으로 나타나며, DHA 처치군의 높은 세포 사멸률은 증가한 4-HNE에 의해 야기된 것으로 예상된다. 이와 같이 인체 혈관 내피세포에서 DHA는 LA 및 AA에 비해 과산화 물의 생성을 증가시켰다. 특히 생성된 과산화물 중 4-HNE는 MDA에 비해 caspase-3 활성도를 증가시켜서 ECV 304 세포의 자가 사멸을 유발하였다. 따라서 고농도의 DHA는 LA 와 AA보다 혈관 내피세포의 자가 사멸을 유도하여 결과적으로는 동맥경화의 원인이 될 것으로 예상된다. 향후 지방산 연구로서 자가 사멸을 일으키는 기전을 자세히 밝혀 볼 필요가 있으며, 최근에 발표되고 있는 DHA의 과산화물의 생성이 불포화도 및 불포화 위치에 기인하는지 혹은 탄소 수에 의한 것인지 확인하기 위해 DHA와 탄소수가 같은 DPA(Docosapenta-enoic acid, C22:5 ω-6)와 비교하여 연구할 필요가 있다.|Docosahexaenoic acid (DHA) was w-3 fatty acid its ability to modulate cell growth or death with changes of apoptotic signaling. Since the mechanism of DHA induced cell death remains poorly understand, we investigated the effects of DHA of apoptosis on human vascular endothelial ECV304 cells. We used final bio-metabolites of lipid peroxidation such as 4-HNE and MDA that were originated by dietary polyunsaturated fatty acids(PUFA). Since DHA or LA or AA can be well incorporated into ECV304 cells compared to control, DHA caused apoptosis of ECV304 cells compared to LA, AA and control as evidenced by changes in cell morphology and MTT assay. LPO(4-HNE+MDA) was not elevated by LA and AA, otherwise LPO(4-HNE+MDA) was elevated 10 fold by DHA compared to control. 4-HNE caused apoptosis of ECV304 cells compared to MDA as evidenced by changes in MTT assay. Since 4-HNE induced apoptosis of ECV 304 cells with evidences of caspase activity. We expected DHA also showed same effects because of high production of 4-HNE. Caspase-3 activity until 48h increased by LA, DHA, AA 4-HNE and MDA Caspase-3 activity increased 2 folds DHA and 4-HNE compare of other groups significantly. Our results strongly indicated that DHA products 4-HNE on ECV304 cell has an important roles on apoptotic signaling pathway. This metabolite, 4-HNE by oxidation of DHA, might be one of risk factor in the initial progression of atherosclerosis.