새송이버섯 추출물의 기능성 검색 및 분리 동정에 관한 연구

Abstract

최근 식물체 내에 존재하며 약리 효과가 뛰어난 기능성 물질에 대한 관심이 높아지면서 약용식물 뿐만 아니라 과일과 채소에 함유된 천연 물질 등에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 또한 가공식품과 인스턴트식품의 이용이 높아지면서 이들 식품의 장기보존을 위해 항산화제, 보존제 같은 첨가물의 사용이 증가함으로써 그 중요성과 함께 개발의 필요성이 더욱 대두되고 있다. 본 연구에서는 큰느타리과의 새송이버섯의 이화학적 특징과 새송이버섯 80%에탄올 추출물을 다시 클로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 이용하여 순차적으로 분획 추출하여 그 수율과 각 추출물 들의 항산화효과 및 항균효과를 확인하였다. 또 에탄올 추출물을 Sepabeads SP-850, Sephadex LH-20 column chromatography를 이용하여 활성성분을 분리하였고, 분리된 활성성분을 이용해 총 폴리페놀함량, DPPH소거능, 전자공여능, 아질산염 소거능 및 SOD활성저해 등을 통해 항산화효과를 확인하였으며 paper disc법으로 항균효과도 확인하였다. 또한 그 활성 성분을 HPLC, Mass spectrometer를 이용하여 분리 동정하였으며 그 물질들의 분자량을 조사하였다. 이상의 연구에서 얻은 결과는 다음과 같았다. 1. 새송이버섯의 이화학적 특성 1) 새송이버섯의 전체, 기둥, 갓 부위별 일반성분 중 수분은 부위별 모두 75%-80%였고 당질은 전체, 갓 부위는 16%정도였지만 기둥은 그보다 조금 높은 19.42%였다. 또한 조지방은 모두 1% 미만으로 낮았으며 조단백질 함량은 갓이 4.92%로 기둥 2.74%에 비해 거의 2배 정도 높게 나타났다. 조회분은 기둥 부위가 0.86%로 다른 부위에 비해 높았다. 동결건조한 새송이버섯 분말의 수분함량은 9.0%였고 당질이 63.06%로 가장 높았으며 조단백질 20.70%, 조회분 5.20% 및 조지방 2.0%의 순이었다. 새송이버섯은 높은 당질 중 식이섬유질이 많은 부분을 차지하고 있어 저열량, 고식이섬유질 식품이다. 2) 새송이버섯 분말의 무기질은 Ca, Cu, Fe, Mn, Mg, Na, K, Zn 등 8종의 무기질이 확인되었다. 모든 부위에서 K의 함량이 가장 높았으며 그다음으로는모든 부위에서 Mg(700.00mg/kg)의 함량이 높았다. 반면 기둥 부위에서는 Mn이 무기질 중 가장 낮은 함량을 보였다. 3) 새송이버섯 분말에서 총당 함량은 30410.0mg%로 매우 높았으며 이를 %함량으로 환산하면 30.41%로 이는 단백질, 조지방 등의 일반성분과 비교하여 매우 높은 함량이었다. 또 환원당은 873.5mg%를 나타냈으며 유리당 중 fructose의 함량이 1671mg%으로 가장 높았으며 maltose 함량이 가장 낮았다. 2. 새송이버섯 추출물의 기능성 1) 새송이버섯 분말을 에탄올로 추출하였고 이를 다시 용매의 극성도에 따라 순차적으로 분획 추출하였는데 에탄올 추출물(EtEx)의 수율은 전체 30.8%, 갓 23.3%, 기둥 15.6%이었다. 에탄올 추출물을 순차적으로 물로 추출한 것(WaEx)의 수율이 다른 용매 재추출물들 중에서 가장 높았고 WaEx의 수율은 전체 18.2%, 기둥 19.4%, 갓 16.3%로 기둥에서 가장 높았다. 이로 인해 새송이버섯 용매 추출물의 수율은 EtEx와 WaEx가 가장 높은 것을 알 수 있었다. 2) 새송이버섯 추출물들의 총 폴리페놀함량은 EtEx의 경우 전체 387mg%, 기둥158mg%, 갓 593mg%로 갓 추출물에 가장 많았다. 새송이버섯 전체의 부탄올 추출물(BuEx)과 WaEx의 폴리페놀 함량이 594mg%와 404mg%로 클로로포름 추출물(ChEx)과 에틸아세테이트 추출물(EAEx) 보다 월등히 높았다. 갓 부위에서도 BuEx에서 폴리페놀 함량이 가장 많았으며 기둥 부위는 EAEx, BuEx 순으로 폴리페놀 함량이 높아 부위별로 폴리페놀함량에 차이를 보였다. 3) 새송이버섯 추출물의 전자공여능은 EtEx에서 갓, 전체, 기둥 추출물이 91.12%, 79.68%, 62.90%의 순이었으며 이는 총 폴리페놀 함량과 같은 경향을 보여주었다. Tocopherol과 BHT의 경우 각각 93.92%, 96.72%인데 비하여 갓의 EtEx와 WaEx에서도 91.12%와 90.39%로 나타나 항산화효과를 확인할 수 있었다. 4) 새송이버섯 추출물별 항균력을 측정한 결과 갓의 WaEx와 BuEx를 제외한 모든 추출물들이 그램 양성균에서 대부분 항균활성을 나타내지 못하였으며 그램 음성 균에서는 Pseudomonas aeruginosa에 대해 전체의 BuEx와 갓의 EAEx, WaEx, 기둥의 EAEx에서 항균활성을 보여주었다. 특히 Escherichia coli에 대하여는 전체, 갓, 기둥 부위의 EAEx, WaEx 모두 항균활성이 있었다. 새송이버섯의 추출물들은 그램 양성균보다 그램 음성균에서 높은 항균활성을 보여주었으며 여러 분획 추출물들 중 EAEx와 WaEx에서 높은 항균효과가 확인되었다. 3. 분리 정제된 새송이버섯 추출물(Sf)의 기능성 1) 새송이버섯 분말의 에탄올 추출물을 HPLC로 분석한 결과 210nm에서는 retention time 6.25, 9.11, 13.95, 31.65 및 48.58에서, 220nm에서는 5.54, 9.25, 24.43, 46.51 및 59.32에서 peak가 나타났다. 이상의 5개 retention time 대별로 Sf-1, Sf-2, Sf-3, Sf-4, Sf-5로 분획하여 mass spectrometer로 분자량을 측정한 결과 Sf-에서는 분자량 314.1인 물질이, Sf-2에서는 144.3, 161.1, 295.0 및 550.9인 물질이 나타났다. 또한 Sf-3 에서는 분자량 298.1, Sf-4에서는 1022.2, Sf-5에서는 844.6, 1014.1 및 1015.0으로 비교적 큰 분자량의 물질들인 것으로 나타났다. 2) Sepabeads로 분리 정제된 Sf를 분자량별로 분리한 결과 No 23, 44 및 59에서 흡광도가 높은 3개의 peak가 나왔다. 이를 각각 Sf-A, Sf-B, Sf-C로 명명하였고 mass spectrometer로 분자량을 측정한 결과 Sf-A에서는 분자량 520.2인 물질이 주를 이루었고 Sf-B에서는 160.9 및 Sf-C에서는 268.0과 325.1인 물질들이 주를 이루었다. 이상의 결과는 SP-850 column chromatography 로 분리 정제한 Sf-1 ~ Sf-5 물질의 분자량이 Sf-1은 314.1, Sf-2는 161.1, Sf-3는 298.1인 것과 유사했다. 3) Sf의 총 폴리페놀 함량은 507mg%로 전체의 EtEx의 총 폴리페놀 함량 387mg%인 것에 비하여 높았으며 전체 BuEx의 594mg%보다 적었으나 다른 추출물의 것 보다는 높았다. 이와 같이 Sf의 총 폴리페놀 함량이 EtEx 보다 높은 것은 Sf가 EtEx에서 분리정제 되었기 때문인 것으로 판단된다. 4) Sf를 토코페롤과 BHT와 같은 농도인 0.02%, 그리고 0.05%, 0.1%로 농도를 달리하여 전자공여능을 측정한 결과 0.02%에서는 57.78%, 0.05%에서는 64.20% 및 0.1%에서는 77.33%의 활성을 보였다. 이것은 같은 0.02%에서는 α-tocopherol과 BHT가 각각 93.92%, 96.72%로 Sf 의 EDA 가 크게 떨어지나 0.1%인 경우에는 16-20% 정도 떨어졌다. 또한 SOD-liked를 측정한 결과 0.02%에서는 α-tocopherol, BHT가 각각 91.30%와 87.26%로 높은 반면 Sf는 0.02%, 0.05%에서는 40.00% 이하였으며 Sf 0.1%에서는 40.5%였다. 그러나 활나물, 들깨박 추출물들의 SOD-liked를 측정한 결과가 30% 내외인 것과 비교하면 Sf의 SOD-liked가 우수한 것이라고 할 수 있었다. 5) Sf의 아질산염 소거능은 0.02%에서 56.25%, 0.05%에서는 70.00%이었으며 0.1%에서는 72.5%를 보여주어 Sf의 농도가 0.05%까지는 농도가 높아질수록 아질산염 소거능도 상승하나 0.05%에서 0.1% 사이에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 6) Sf의 linoleic acid 에 대한 항산화 효과는 0.02%와 0.05%인 때의 TBA가 모두 control 보다 낮아 linoleic acid의 자동산화를 억제시키는 것으로 나타났으며 특히 저장 24시간에서는 control의 TBA가는 0.823인데 반하여 Sf 0.02%는 0.475, 0.05%는 0.465로 1/2정도로 낮게 나타나 산화 억제 효과가 큰 것으로 나타났다. 그러나 Sf 0.02%와 0.05% 첨가 농도 차이에 따른 항산화효과의 크기에는 큰 차이가 없었다. 이와 같은 Sf의 항산화효과는 저장 24시간에서 α-tocopherol의 0.502 보다는 낮았고 BHT의 0.423과는 유사한 TBA가를 보여 α-tocopherol보다는 크고 BHT와는 거의 유사한 항산화효과를 보였다. 7) Sf를 대두유에 0.02%, 0.05% 첨가하여 60±2℃에서 24일간 항온저장하면서 과산화물가(POV)와 공액이중산가(CDV)를 측정하였다. POV에 의한 항산화효과는 TBHQ > BHT > Sf 0.05% > Sf 0.02% > α-tocopherol의 순이었다. 이때 control의 유도기간은 10.3일이었으며 α-tocopherol이 8.5일, Sf 0.02%와 0.05%는 각각 11.5일과 12.6일, BHT 14.8일 이었다. 또한 상대적 항산화효과(RAE)는 Sf 0.02%와 0.05%에서 각각 122.3, 111.6 이었다. CDV는 Sf 0.02%와 0.05%인 경우 초기 0.32%였던 것이 저장 9일에는 0.86%, 0.74%였고 저장 24일에는 3.33%, 2.99%으로 이는 control, α-tocopherol보다 낮고 BHT와는 유사한 것으로 나타났다. 따라서 새송이버섯 EtEx에서 정제 분리된 Sf는 대두유에 대한 항산화 효과 정도는 BHT 보다 약간 떨어지나 거의 유사한 항산화 효과를 보여주어 새송이버섯의 Sf를 천연 항산화 물질로 사용하는 것이 가능하다고 생각된다. 8) Sf를 0.1%로 희석하여 항균력을 측정한 결과 그램 양성균인 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes 중 Bacillus cereus에 대해 높은 항균 효과를 보여주었으며 Staphylococcus aureus와 Listeria monocytogenes에 대해서도 중간 정도의 항균 효과를 확인하였다. 또한 그램 음성균인 Escherichia coli, Salmonella typhimurium 및 Pseudomonas aeruginosa에 대해서 모두 중간 정도의 항균 효과를 보였고 그 중 Escherichia coli와 Pseudomonas aeruginosa에서는 13mm의 clear zone을 형성하여 강한 항균력을 보여주었다. 이상의 결과로 Sf는 그램 양성, 음성균 모두에서 강한 항균효과가 있는 것을 알 수 있었다. 본 연구결과 새송이버섯의 전체, 갓, 기둥 중 갓추출물의 항산화 및 항균효과가 다른 부위보다 우수하였으며, 용매추출물의 경우 에탄올 추출물이 가장 높은 수율과 항산화효과를 나타내었다. 또한 새송이버섯 EtEx에서 분리 정제된 Sf는 유지에 대한 항산화효과는 α-tocopherol 보다 높고 BHT와 거의 유사하며 아질산염 소거능 및 항균효과가 뛰어나며 그러한 효과를 나타내는 물질들의 분자량은 520.2, 160.9, 325.1 인 것임을 알 수 있었다.|In this study, the proximate properties, detection of functionality and classification and identification were researched on the extract of Pleurotus eryngii. Some major functions of the Pleurotus eryngii extracts such as their antioxidative effects, nitrite scavenging ability, and antimicrobial activity of the Pleurotus eryngii extracts were researched. Also the amounts of proximate components, minerals, free sugar, total sugar, reducing sugar, total dietary fiber and calorie of Pleurotus eryngii were investigated. The Pleurotus eryngii extracts were prepared from ethanol extraction of freeze dried Pleurotus eryngii powder. The solvents used redistilled were as follows ; water(Wa), ethanol(EtOH), chloroform(CHCl3), ethyl acetate(EtAc), and butanol(BuOH). Their antioxidant effects on the soybeanoil were measured by EDA(electron donating ability) and total polyphenol amounts of each solvent extract. And also the antimicrobial activity of each extract was evaluated by testing the paper disc agar diffusion method. In order to find out the functional component, ethanol extract (EtEx) was fractionated upon flewtime and purified by Sepabeads SP-850, Sephadex LH-20 column chromatography and high performance liquid chromatography(HPLC). The molecular weight of functional component among three fractionations were determined by use of high performance liquid chromatography(HPLC) and mass sectrometer (MS). The antioxidant effects of the functionality substance fraction(Sf) were measured by total polyphenol amounts, EDA(electron donating ability), SOD-liked activities, and Nitrite scavenging effects. And then the antioxidative effects of various concentrations(0.02, 0.05%) of the Sf(subfraction of Pleurotus eryngii ) on soybean oil used as substrate were determined by measuring the peroxide value (POV) and conjugated dienic value (CDV) of the substrates stored at 60±2℃ for 24 days. And in order to compare antioxidative of Pleurotus eryngii extract induction period (IP) based on 100 meg/kg.oil of POV and relative antioxidant effectiveness (RAE) were determined for soybean oil with or without extracts and other antioxidants. RAE was calculated as the percent ratio of IP of a sample oils to the IP of the control. And then the antimicrobial activity of the Sf fraction were evaluated by testing the paper disc agar diffusion method. Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Pseudomonas aeruginosa were used as microorganism. The results were obtained as follows ; 1. The proximate composition of Pleurotus eryngii. 1) The amount of water in 3 parts( whole body, stipe, and pileus) of the fresh P. eryngii was 75~80%. But in the P. eryngii powder moisture was contained 9.0% and carbohydrate, crude protein, crude ash and crude fat were contained 63.06%, 20.70%, 5.20%, and 2.0% respectively. 2) Potassium(K) was the highest amount, while manganese(Mn) was the lowest amount among minerals detected. And also the amounts of free sugar were high in order as follows. : fructose > galactose > glucose > lactose > maltose 2. The functionality of Pleurotus eryngii extracts by various solvents 1) The Pleurotus eryngii freeze dried powder(P. eryngii powder) was extracted firstly, the name of thet extract was used as EtEx. The amounts of EtEx in whole body, pileus, and stipe) were obtained as same as 30.8, 23.3, and 15.6% respectively. And then the second extration was carried on the EtEx using by various solvents like as chloroform, ethyl acetate, butanol, and water. Each re-extract name were ChEx, EAEx, BuEx, and WaEx respectively. The yield ratio of WaEx was the hightest among re-extracts and WaEx was shown higher level in stipe(19.4%) than whole body(18.2%), pileus(16.3%). 2) The amounts of polyphenol in EtEx were measure as 387mg% in whole body, 158mg% in stipe, and 593mg% in pileus. Comparing the amounts polyphenol upon the part of P. eryngii powder, BuEx (594mg%) and WaEx(404mg%) were high level in whole body, BuEx was the highest in pileus, and EAEx, BuEx were higher than other extracts in stipe. It could be found that some differences of polyphenol amounts were existed upon parts of P. eryngii and kind of solvents. 3) The electron donating ability(EDA) of EtEx were the highest as 91.12% in whole body but the lowest as 62.90% in stipe of P. eryngii powder. Also EDA of WaEx was shown to 90.39% in whole body, these EDA values are similar to those of tocopherol(93.93%) and BHT(96.72%), so it could be expected that these extracts would be acted as a antioxidants. 4) Some of extracts were certified to have antimicrobial activities for a few micro organisms , specially for gram negative micro organism. In other words, BuEx, EAEx in pileus and WaEx in stipe had inhibited the growth of Psedomonas aeruginosa(gram negative). Also EAEx and WaEx in all parts were shown to be acted as a antimicrobial agents for Escherichia coli(gram negative). 3. The functionalities of isolated and identified fractions from EtEx of P. eryngii powder. 1) In order to find out the functional substances(Sf) existed in EtEx, EtEx were purified by Sepabeads SP-850 column chromatography, and then fractionated into Sf-1, 2, 3, 4, 5 upon retention time by HPLC. And their molecular weight were measured by mass spectrometer. The molecular weight were certified one or two substances in each Sf. There were detected Mw 314.1 in Sf-1, 144.3, 161.1, 295.0, 550.9 in Sf-2, 298.1 in Sf-3, 1022.2 in Sf-4, and 844.6, 1014.1, 1015.1 in Sf-5. 2) Also three peaks were presented in Sf which were classified and purified with Sepabeads, the name of each peak was called Sf-A, B, C respectively. The molecular weight of main substances in Sf-A were determined as 520.2, 160.9 in Sf-B, and 268.0, 325.1 in Sf-C by mass spectrometer. These results were similar to results setermined by Sepabeads column chromatography. 3) The amounts of polyphenol was measured as 507mg% in Sf, which was higher than that in EtEx and was lower than that in re-extract, BuEx, but was higher than that in other re-extracts. 4) The EDA of soybean oil added with 0.02-0.1% Sf was measured as level of 57.7-77.3%, so it's EDA was lower than those of α -tocopherol(93.93%) and BHT(96.72%). Also the SOD-liked Sf was almost under half value of those of α-tocopherol and BHT. And the nitrite scavenging effects of Sf were determined as the level of 56.25-72.5%. At that time the fact was known that the effects were more increased, the adding concentrations were higher until 0.1%. So generally like these properties were known to be lowered after classifying and purifying process. 5) The TBA values of linoleic acid with 0.02-0.05% of Sf were lower(0.475-0.465) than those of control(0.823), α -tocopherol (0.502), so Sf could be certified to have antioxidative effects were sustained until 24 hours, also degree of the antioxidative effects were almost same to that of BHT, and were higher than that of α -tocopherol for linoleic acid. 6) When the antioxidative effects of Sf added as level of 0.02-0.05% and other artificial antioxidants 0.02% in soybean oil were determined by POV, the antioxidative effects were obtained as follows ; TBHQ > BHT > Sf 0.05% > Sf 0.02% > α-tocopherol. At that time, the induction periods were shown to 10.3 days in control, 8.5 days in α-tocopherol, 11.5 days in Sf 0.02%, 12.6 days in Sf 0.05%, and 14.8 days in BHT. In case of CDV, it was shown that had similar tendencies to POV. Therefore it was thought that Sf could be expected to use as a natural antioxidants in future. 7) And also it was found out that moderate antimicrobial activities of Sf were identified in gram positive micro organisms such as S. aereus, B. cereus, L. monocytogenes that was different result from varios solvents extracts before classifying and purifying. While strong antimicrobial activities were certified in gram negative micro organisms such as E. coli and P. aeruginosa. Following above results, it will be summerized that the pileus of P. eryngii had have the highest antioxidative effect and antimicrobial activity comparing with whole body and stipe. And ethanol extract and re-extracts from ethanol extracts of P. eryngii were shown to have antioxidative and antimicrobial activity. Also isolated and purified extract from ethanol extract had have high antioxidative and antimicrobial activity, these effects were almost same to or a little lower than that of BHT and higher than that of α-tocopherol. In addition to those effects, they had have excellent nitrite scavenging ability. Like these effective main compounds existed in P. eryngii were certified that as molecular weights were detected as 520.2, 160.9, and 325.1. It would be proposed that P. eryngii is main food material of various dishes and can become a new natural source for antioxidative and antimicrobial agents in future food industry. Also it has merit to cultivate mass production in narrow space and in short time, so it could be used large amounts anytime when it was needed. Therefore it will be expected that P. eryngii will be contributed more widely in life science.