Apo E KO 동맥경화 동물 모델을 이용한 인삼의 항동맥경화 및 인슐린 저항성 효과 연구

Abstract

인삼은 아시아에서 수천 년 동안 여러 질병을 치료하는데 전통적으로 사용되어왔으며, 인삼에 존재하는 활성성분 중에서 가장 큰 생리활성을 지닌 ginsenoside는 항염증, 항산화, 항암효과와 함께 혈관내피세포에서 NO(nitric aicd) 생산을 자극시켜 항동맥경화 효과와 같은 여러 가지 유익한 영향을 다양하게 나타내는 것으로 알려져 있다. 하지만 지금까지 인삼의 생리활성 성분에 대한 연구들은 단일성분 중심으로 이루어져 왔으며, ginsenoside 성분의 혼합효과 및 비율조절에 따른 시너지 효과 연구는 거의 이루어지지 않은 실정이다. 따라서 인체 생리 전반에 관한 연구의 필요성에 따라 인삼의 특징인 효능의 다양성을 검증하기 위해 인슐린 저항성으로 인한 대사증후군 및 동맥경화증에 대한 약리작용 및 그 기전에 대해서 확인해보고자 한다. 본 연구는 PD:PT 비율 조절에 따른 인삼 투여가 인슐린 저항성 및 동맥경화증에 미치는 영향을 알아보고자, 동맥경화 동물 모델인 apo E KO 마우스를 사용하여 E(+/+)군을 음성 대조군으로 E(-/-)군을 양성 대조군으로 하였고, 인삼 투여군은 PD:PT=1군(동체 5:세근1)과 PD:PT=2군(지근1:세근5)으로 나누었다. 총 12주간의 실험기간 동안 모든 실험군에게 고콜레스테롤 식이(1.25% 콜레스테롤, 7.5% 코코아 버터)를 주어 동맥경화병변 및 인슐린 저항성 증가를 유도시켰다. 마지막 4주 동안의 실험기간에는 음성 대조군과 양성 대조군에게는 매일 생리식염수를 복강 내(intrapertoneal, i.p.)로 투여하였으며, 인삼 투여군은 인삼추출물을 체중 kg 당 100mg 농도로 매일 복강 내(i.p.)로 투여하였다. 매 주마다 식이섭취량, 체중증가량을 측정하여 평균을 구하고 식이효율을 계산하였다. 12주간의 사육 기간 후 희생시켜 얻은 혈장과 심장, 간, 부고환 지방조직에서 간 효소수치, 지질수치, 지질과산화물, 아디포넥틴 함량을 분석하였고, 심장조직의 괴사정도를 TUNEL 방법을 사용하여 확인하였다. 각 조직에서 western blot 방법을 이용하여 인슐린 신호전달체계, 염증 기전(COX-1,2 /Ikb-α /p-IkB-α /NF-kB) 및 자가 사멸(bcl-2 /caspase-3,8,9 /c-PARP) 작용기전에 대해서 관찰하였다. 본 논문의 실험결과는 다음과 같았다. 1. 체중변화에는 모든 실험군에서 유의한 차이를 나타내지 않았지만, PD:PT=1군이 가장 큰 체중감소효과를 나타냈다. 또한 PD:PT=1군에게서 식이섭취량과 식이효율이 모두 유의적으로 가장 높게 나타났다. 2. 혈장에서의 간 효소 AST, ALT 수치는 E(+/+)군에 비해서 각 실험군은 유의적인 증가를 나타냈다. 인삼 투여군은 E(-/-)군에 비해 유의적인 감소를 보였으며, 혈장의 결과로는 PD:PT=1군이, 간 조직에서는 PD:PT=2군이 간 조직 손상을 감소시키는 경향을 나타냈다. 3. 혈장, 심장, 간 조직에서의 지질 수치를 살펴보면, 중성지방(TG), 총 콜레스테롤(TC), HDL 콜레스테롤(HDL-C) 수치는 E(+/+)군에 비해서 각 실험군이 모두 유의적으로 증가하였다. 혈장에서는 PD:PT=1군이, 심장 조직에서는 두 인삼 투여군이 비슷하게 지질 수치 개선 효과를 나타냈다. 간 조직에서는 TC 함량에는 PD:PT 비율에 따른 인삼 투여가 감소 효과를 주지 못하였으나, PD:PT=1군이 지질수치 개선효과를 나타냈다. 4. 지질과산화물(lipid peroxidation, LPO)을 측정한 결과 E(-/-)군은 E(+/+)군에 비해서 혈장, 심장 간 조직에서 유의적으로 증가하였다. 혈장에서는 PD:PT=1군과 PD:PT=2군이 비슷한 감소효과를 나타냈으며, 심장 조직에서는 PD:PT=2군이, 간 조직에서는 PD:PT=1군이 LPO를 감소시켰다. 즉, LPO 감소효과는 조직에 따라 PD:PT 비율에 따라 다른 경향을 보였다. 5. 혈장의 아디포넥틴 분비는 E(-/-)군에 비해 각 실험군 모두에서 감소하였으며, 특히 PD:PT=2군이 유의하게 감소하였다. 지방조직에서 아디포넥틴 함량은 E(-/-)군에 비해서 PD:PT=1군이 약 2배로 유의한 증가를 보였으며 PD:PT=2군에서는 유의적인 증가를 나타내지 않았다. 6. 인슐린 저항성 개선효과로써 혈장에서 Insulin Receptor β의 발현은 E(-/-)군은 E(+/+)군에 비해 0.7배 발현이 감소하였으나 PD:PT=1군과 PD:PT=2군은 각각 2.8배, 1.8배로 증가하였다. Phospho-IRS-1(ser612)의 경우 E(-/-)군은 E(+/+)군에 비해서 1.3배 발현이 증가하였지만 각 인삼 투여군에서 각각 0.8배, 0.9배로 발현이 감소하였다. 7. 염증반응에 미치는 영향을 살펴보면, 성장인자나 발암물질 등에 의해 유도되는 COX-1,2 발현이 PD:PT=2군에서 더 많이 억제되었다. Ikb-α 안정화에는 PD:PT=1군이 효과적으로 작용을 하였으며, Ikb-α 인산화 억제와 NF-kB p65 발현 억제에는 PD:PT=1군과 PD:PT=2군이 모두 효과적으로 발현을 감소시켜주었다. 또한 세포의 자가사멸 기전에 미치는 영향은 bcl-2의 경우 인삼 투여군에서 모두 발현이 증가되었으며, 특히 PD:PT=1군이 발현을 증가시켰다. 하지만 cytochrome C와 caspase-3의 발현에는 인삼 투여군이 큰 억제효과를 주지 못하였다. 그러나 caspase-8,9의 발현에서는 각 인삼 투여군이 모두 크게 발현을 억제시켰는데, 특히 PD:PT=2군에게서 caspse-8,9의 발현 억제가 크게 나타났다. 자가사멸의 마지막 생성 반응물인 cleaved-PARP의 경우도 인삼 투여군에게서 억제되었으며 PD:PT=2군이 PD:PT=1군 보다 더 크게 발현을 억제시켰다. 8. 심장 조직의 괴사정도는 E(+/+)군에 비해서 모든 실험군이 유의적으로 증가하였으며, PD:PT=1군은 E(-/-)군에 비해 심장 조직의 괴사가 유의하게 감소한 반면 PD:PT=2군은 유의한 감소를 보이지 않았다. 정상세포의 수준역시 유의하지는 않지만 괴사세포와 같은 경향을 보였으며, PD:PT=1군에게서 정상세포의 생존이 높게 나타나는 것을 통해서 심혈관질환에 보다 유의한 개선효과를 나타내었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, PD:PT=1군에게서 체중 증가 억제와 식이효율이 유의하게 증가하였으며, PD:PT=2군은 간 보호효과에 유익한 영향을 나타냈다. 고콜레스테롤 식이는 E(-/-)군의 LPO 생성을 유의하게 증가시켰으며, 인삼 투여시 LPO 생성이 모두 감소되었는데, PD:PT=1군은 혈장과 간 조직에서 유의한 감소를 보였으며 PD:PT=2군은 혈장과 심장조직에서 유의한 감소를 나타냈다. 지방조직에서의 아디포넥틴 함량은 PD:PT=1군이 E(+/+)군에 비해 2배 이상의 증가를 보였지만, 혈장에서는 감소하였다. 인슐린 저항성과 관련되어 PD:PT=1군과 PD:PE=2군은 Insulin Receptor-β 발현을 증가시켜주었고 Phospho-IRS-1(ser612) 발현을 억제시켜주었는데, PD:PT=1군이 인슐린 감수성 증가에 더 효과적임을 알 수 있었다. 친 세포사멸기전에 관여하는 COX-1, COX-2, cytochrome C, caspase-3,8,9, c-PARP의 발현은 cytochrome C와 caspase-3을 제외하고 모두 억제되었으며, PD:PT=2군의 억제효과가 크게 나타났다. 항 세포사멸기전에 관여하는 bcl-2의 경우 PD:PT 비율조절에 의해 발현이 증가하였으며, 특히 PD:PT=1군이 더 큰 증가를 나타냈다. 염증반응에서도 친 염증물질은 NF-kB와 p-IkB-α 발현 억제에는 PD:PT=2군이 효과적이였으며 항 염증물질인 Ikb-α 발현 증가에는 PD:PT=1군이 효과적으로 나타났다. 또한 PD:PT=1군이 심장 조직의 괴사 정도를 유의하게 감소시켰으며, 정상세포의 빈도가 높았음을 통해 PD:PT=1에 의한 bcl-2 발현 증가에 의한 심혈관계개선 효과에 의한 것이라고 생각해 볼 수 있다. 결론적으로 인삼의 ginsenoside의 추출부위에 따라 각기 다른 PD:PT 비율 조절의 작용효과는 작용기관에 따라서 서로 다른 영향을 주며 아울러 항동맥경화, 항염증 및 자가사멸 억제 기전에도 그 효과가 다르게 나타났다. 따라서 향후연구로써는 ginsenoside의 각각 성분의 효과와 성분 간의 상호작용 등에 대한 기전 여구가 요구되고 아울러 mitochondria damage성 자가사멸 기전과의 상관성 연구가 필요하다.|Ginsenosides, the principal active components of ginseng, have been shown to possess a variety of beneficial effects on human health, including anti-inflammatory, antioxidant and anticancer effects. There are two major classes of ginsenosides, namely protopanaxadiol (PD; Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rh2) and protopanaxatriol (PT; Rg1, Rg2, Re, Rf, Rh1). In this study, the atherogenic and insulin resistance effects of PD:PT ratio were examined in atherosclerosis-susceptible C57BL/6J, apolipoprotein E-deficient mice. To test this, 4 group of mle apo E deficiency mice was fed high-cholesterol diet for 12 weeks. Negative and positive control received daily intraperitoneal injection of saline for last 4 weeks. Ginseng treated animal of differential PD:PT ratio injected at an intrapertionel dose of 100mg/kg for last 4 weeks. Plasma, heart and liver tissue measured lipid profiles and lipid peroxidation(LPO) products. Also Plasma and fat tissue measured adiponectin concentration. Each tissues investigated insulin signaling, inflammation and apoptosis mechanism through western blot assay. Heart tissue was immunohostochemistry and TUNEL. Aorta tested H&E for lipid accumulation. The results are summarized as follow; 1. PD:PT=1 was significantly effected that supressed weight gain and increased food efficiency for fed high-cholesterol diet. 2. For liver protective effect of high-cholesterol diet-induced liver damage was that PD:PT=1 significantly decreased in plasma, but PD:PT=2 significantly decreased in liver tissue. 3. Diffrential PD:PT ratio of lipid profile was that TG and TC significantly decreased each tissue and plasma HDL-C was significantly increased. Ginseng treated group shows that lipid profiles improved depend on tissues. 4. The plasma LPO product similar reduced in PD:PT=1 and PD:PT=2. PD:PT=2 significanlty reduced in the heart tissue, but hepatic LPO product reduced in PD:PT=1. 5. Adiponectin released fat tissue was significantly increased in PD:PT=1 but circulated adiponectin concentration was not effective. 6. Insluin Receptor-β expression increased that 3 times in PD:PT=1 and 2 times in PD:PT=2 and Phospho-IRS-1(Ser612) expression suppressed 0.8 times and 0.9 times in each. 7. pro-apoptotic molecular suppression was effected in PD:PT=2 and anti-apoptotic molecular expression was effected in PD:PT=1. In summary, differential PD:PT ratio has several effects in anti-atheroscleerosis and improved insulin resistance. First, PD:PT=1 decreased weight gain cause high-cholesterol diet. Second, differential PD:PT ratio decreased TG and TC level. Also it was increased in plasma HDL-C and reduced LPO product in each tissue. So removed harmful free radical from body and increased activity of antioxidant enzyme. The PD:PT=1 increased anti-apoptotic and anti-inflammation molecular expression. On the other hand the PD:PT=2 suppressed nti-apoptotic and anti-inflammation molecular expression. So differential PD:PT ratio showed that atherosclerosis factor decreased through suppression of COX-1,2, NF-kB activity and caspase-8,9 and increased insulin sensitivity.