A549 Lung Cancer Cell에서 사과 농축액에 의한 NFkB 활성 억제 효과에 관한 연구

Abstract

논문개요

본 연구는 인간 폐암 세포인 A549 세포에서 사과 농축액과 Quercetin 3-β-D glucoside(Q3G)에 의한 세포 생장 억제 기전을 연구하였다. 세포 생장 억제 기전의 지표인 Nuclear factor-kappa B(NFκB)와 Phospho-IκBα(p-IκBα)의 영향을 알아보기 위해 사과 농축액 0, 5, 10, 20, 50 mg/mL와 사과의 대표적인 성분인 Q3G 0, 5, 10, 50, 100 μM 농도로 시료를 처리하고 NFκB의 핵 내 유입을 유도하기 위해 10 ng/mL의 TNF-α를 처리하여 세포 증식에 미치는 영향, NFκB의 함량 변화, NFκB의 핵 내 유입 유도 효소인 proteasome의 활성 억제 정도를 분석하였다.

1. 세포 독성(Cytotoxicity) 및 세포 증식(Cell Proliferation)의 변화는 Methylene blue법과 MTT법으로 분석하였으며 세포의 독성은 10%미만의 독성율을 나타낸 농도를 세포에 급성독성을 미치지 않는다고 보았다. 사과 농축액을 처리한 세포의 경우 40 mg/mL 이하의 농도에서 10%미만의 독성율을 나타냈고 60-200 mg/mL의 농도에서는 11.7-47.7%로 독성율이 증가하였다. Q3G를 처리한 세포의 경우 10%미만의 독성율을 나타낸 농도는 130 μM 이하였으며 10, 160, 200 μM 농도에서도 14.4, 10.9, 16.2%의 독성을 나타낸 것으로 나타났다. 세포의 증식은 사과 농축액을 처리한 세포의 경우 10, 20 mg/mL의 농도에서 증가하는 경향을 보이다가 40 mg/mL 이상의 농도부터는 농도가 증가 할수록 감소되었고, Q3G를 처리한 세포의 경우 전체적으로 증식의 감소가 나타났다. 이를 통하여 사과 농축액 및 Q3G가 A549 인체 폐암세포에 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인 할 수 있었다.

2. A549 폐암세포 핵 내 NFκB의 변화는 western blot법으로 분석하였다. 사과 농축액을 5 mg/mL로 처리 하였을 때 증식이 다소 증가되는 경향을 나타내었으나 처리농도가 10, 20, 50 mg/mL로 증가 되면서 band가 나타나지 않았고, 정량 결과 NFκB의 발현 값이 control과 같은 100%로 나타났다. 이를 통계 처리한 결과 유의적으로(p<0.0001) 감소하여 시료의 농도가 증가 할수록 NFκB가 감소되는 경향을 나타내었고 이를 통해서 NFκB의 감소가 A549 폐암세포의 증식억제와 관련성이 있음을 확인할 수 있었다. 반면, Q3G를 처리한 A549 폐암세포에서 western blot법 결과 Q3G 5, 10, 100 μM 농도에서 NFκB가 0 μM에 비해 소폭 증가하였고 50 μM의 농도에서 감소했지만 큰 차이가 없는 것으로 나타나 본 연구에서는 Q3G가 NFκB의 핵 내 유입은 억제하지 못하는 것으로 나타났다.

3. A549 폐암세포 세포질 내 IκBα의 변화는 western blot법으로 분석하여 사과 농축액을 농도별로 처리 하였을 때의 증식억제는 p-IκBα는 농도가 증가함에 따라 감소하는 것을 알 수 있었다. 이를 정량하여 수치화한 결과는 5 mg/mL의 농도에서는 다소 증가하는 양상을 보이다가 10 mg/mL 이상의 농도부터는 그 농도가 증가 할수록 p-IκBα가 감소하는 것으로 보아 사과 농축액은 IκBα가 인산화 되는 것을 억제하여 NFκB의 핵 내 유입이 감소되는 것으로 생각되었다. 통계 분석 결과에서 0.05이하 수준의 유의성(p=0.0301)이 확인 되었다. 이를 통하여 사과 농축액의 영향으로 IκBα가 인산화 되는 것을 억제하여 A549 폐암세포의 증식억제가 나타난 것으로 해석된다.

4. 세포질 속에 있는 IκBα 분해 및 NFκB의 핵 내 유입 유도 효소인 proteasome은 형광계를 이용하여 측정하였다. 사과 농축액의 농도가 증가 할수록 proteasome의 활성이 감소하는 경향을 나타내었고 특히, 사과 농축액을 50 mg/mL 농도로 폐암세포에 처리한 시료에서 11.3%로 가장 낮은 proteasome의 활성을 보였고 유의적으로 감소하였다(p<0.0001). 반면 Q3G를 처리하여 얻은 세포질의 proteasome 활성은 0 μM과 비교하여 농도가 5, 10, 50, 100 μM로 증가 할수록 50%내외로 감소된 활성이 나타났으며 그 중 50 μM에서 48%로 비교적 가장 낮은 proteasome의 활성 감소를 보였다. 통계 처리한 결과에서는 유의적인 결과가 p=0.0914로 나타났다. 이를 통하여 사과 농축액이 proteasome의 활성을 억제함으로 IκBα 분해 및 NFκB의 핵 내 유입 유도를 억제함에 따른 A549 인체 폐암세포의 증식억제를 나타낸 것으로 해석된다.

이상의 결과를 종합해 보면 사과 농축액의 처리는 폐암세포에서 세포의 증식의 감소를 나타냈고, proteasome의 활성 감소와 NFκB 발현 감소를 확인함으로써 proteasome의 활성 감소를 통해 NFκB의 핵 내 유입의 억제되는 결과를 볼 수 있었다. 폐암세포의 증식에서는 Q3G를 처리한 세포에서 증식감소도 나타나며 농도가 증가하여도 20%이하의 급성 독성율이 나타나는 것으로 보아 사과에서 정제된 물질인 Q3G가 세포 증식 억제에는 효과적인 것으로 사료된다. 그러나 암의 발생, 세포의 증식, 분화 세포자기사멸, 염증반응 및 세포 내 신호전달계를 포함한 다양한 생물학적 반응의 중심적인 역할을 하는 전사조절인자인 NFκB의 발현 감소와 이 NFκB가 핵 내로 유입되는 것을 돕는 효소인 proteasome의 활성 감소를 보이는 것은 사과 농축액의 영향이 더 큰 것으로 나타나서 NFκB억제를 통한 항 폐암에는 사과 농축액이 효과적인 것으로 사료된다. 하지만 사과의 주성분으로 잘 알려진 것이 Q3G인데 폐암세포의 증식 감소를 나타낸 것이 사과의 성분 중 quercetin의 영향인지의 상관관계가 불분명하므로 사과 농축액을 분획하여 사과 성분 중에서 폐암세포의 억제에 직접적인 영향을 미친 성분을 밝혀내고 그 기작을 확인하는 연구가 계속적으로 이루어져야 하며 더 나아가 사과를 이용한 항 폐암 기능성 식품 및 약제의 개발이 시급하다.| Lung Cancer is the one of the major causes of mortality and 30 deaths/100,000 populations of all deaths(497.3 deaths/100,000 populations) were caused by cancer-related diseases in the Korea in 2009. Effects of apple extracts and quercetin 3-β-D-glucoside(Q3G) on A549 human lung cancer cell proliferation and the mechanism of these phytochemicals in regulating apoptosis and cell cycle arrest were investigated. A549 cells were treated with apple extracts(0-200 mg/mL) and Q3G(0-200 μM) at 37℃ for 24 hr or 96 hr and cell viability was measured with Methylene blue solution (Methylene blue) assay and measured with 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Apple extracts and Q3G inhibited A549 lung cancer cell proliferation in a dose-dependent manner. Nuclear factor κB (NFκB) is a transcription factor, which plays an important role in inflammation, cell proliferation, apoptosis, and immunity in eukaryotes. In cancer cells, NFκB induces resistance to anticancer chemotherapeutic agents by increasing cell proliferation and inhibiting apoptosis. Therefore, inhibition of NFκB activation in cancer cells is advantageous in cancer therapy by lowing the resistance to chemotherapy. Apple extracts(0, 5, 10, 20, 50 mg/mL) significantly inhibited the TNF-α-induced NFκB activation at a dose of 10-50 mg/mL (p<0.0001) and Q3G(0, 5, 10, 50, 100 μM) a slight increased the TNF-α-induced NFκB activation. These results suggest that Apple extracts inhibit A549 lung cancer cell proliferation and regulate the expression of the proteins involved in apoptosis and cell cycle. Phytochemicals from fruits, apple extracts and Q3G have been reported to inhibit NFκB activation, but the mechanisms of how the phytochemicals work have not been fully understood. Apple extracts significantly inhibited the TNF-α-induced phospho IκBα(p-IκBα) activation at a dose of 10-50 mg/mL (p<0.05). These results suggest that apple extracts inhibit A549 lung cancer cell proliferation and regulate the expression of the proteins involved in apoptosis and cell cycle. Apple extracts significantly inhibited proteasome activation dose dependent at a dose of 50 mg/mL to 11.3% (p<0.0001) and Q3G a slight inhibited proteasome activation at a dose of 5-100 μM to 53.3, 50.9, 48 and 50.4%. These results suggest that Apple extracts inhibit A549 lung cancer cell proliferation and regulate the expression of the proteins involved in apoptosis and cell cycle.