퇴행성 뇌 질환에 관여하는 단백분해효소의 실시간 활성 탐색을 위한 화학 프로브의 개발

Abstract

화학 프로브는 특정 단백질과 선택적으로 결합하여 단백질의 기능 및 활성을 탐색할 수 있는 저분자 물질로 기초 및 응용 화학, 생물학연구에서 많이 활용되는 도구이다. 본 연구에서는 퇴행성 뇌 질환과 관련이 있는 여러 특정 효소와 선택적으로 반응하여 형광 신호를 나타내는 화학 프로브 및 특정 세포소기관을 타깃으로 하는 분자 수송체를 합성하여 이들의 생화학적 특성을 탐색하였다. 첫째, Asparaginyl endopeptidase (AEP 또는 legumain)를 타깃으로 하는 활성 기반 프로브(activity-based probe)를 합성하고 살아있는 세포 및 추출물에서 프로브의 형광 신호 변화를 다양한 분석기법을 활용하여 탐색하였다. 기존에 개발된 활성 기반 프로브의 구조와 달리 본 연구에서는 warhead에 전자 분포 변화에 따라 형광 신호가 변하는 특성을 갖는 naphthalimide 유도체를 접합함으로써 효소와의 선택적 반응을 통해 형광 신호가 증가하도록 디자인된 스마트 프로브를 합성하였다. SDS-PAGE 실험을 통해 세포 추출물 및 살아있는 세포에서 프로브와 효소 간의 선택적인 반응 및 세포막 투과성을 확인하였으며, 공 초점 현미경을 이용하여 여러 종류의 살아있는 세포에서 AEP의 활성을 관찰하였다. 둘째, 펩타이드 모사체인 펩토이드 구조를 활용하여 mitochondria-targeting transporter를 디자인 및 합성하고 이들 물질의 세포 내에서의 분자 수송 양상 및 효율을 탐구하였다. 기존에 연구된 peptide 기반 mitochondria-targeting transporter는 mitochondria의 inner mitochondrial membrane (IMM)의 특성으로 인해 세포 내부로 분자가 들어가는 것이 어려울 뿐만 아니라 proteolysis reaction에 의해 분해가 잘 일어나 살아있는 생체 모델에 적용 시 효율이 떨어진다는 단점이 있다. 본 연구에서는 peptide의 특징은 유지하면서 기존의 단점을 극복하기 위해 backbone의 α-carbon이 아닌 질소 원자에 곁가지가 붙어 있는 peptoid 를 이용해 mitochondria-targeting peptoid (MTP)를 합성하였으며 이들 MTP 라이브러리가 mitochondria로 선택적으로 수송되는 정도를 정량하였다. 먼저 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 mitochondria와 선택적으로 결합하는지 확인하였으며, JC-1 assay를 통해 세포 독성을 확인하였고 flow cytometry (FACS)를 이용해 살아있는 세포에서의 형광 광도를 측정하여 각 물질의 세포 투과도를 정량하였다. 셋째. High temperature requirement A (HtrA)에 선택적으로 결합하는 활성 기반 프로브를 디자인 및 합성하였다. HtrA는 serine protease의 한 종류로 mitocondria에서 다양한 신경 전달 경로를 유발 및 조절 하는 등 다양한 cellular processes에 중요한 역할을 하며 특히 알츠하이머에 원인 중 하나인 tau protein의 분해와도 연관이 있다고 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 여러 가지 HtrA 활성 기반 프로브를 디자인 및 합성하여 다양한 serine protease와의 선택성을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 본 연구를 통해 개발된 활성 기반 프로브들은 AEP 및 HtrA의 활성 변화와 이들효소가 관여하는 다양한 생화학적 경로를 확인하는데 유용한 도구로써 활용될 수 있으며, 나아가 퇴행성 뇌 질환의 발병 기전을 설명하는 데 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다