천연색소 단백질 피코에리트린에 관한 연구

Abstract

최근 인공합성색소를 대체할 수 있는 천연색소의 관심이 증가하고 있다. 천연색소는 인공합성색소와 다르게 인체에 대한 독성이 낮거나 무해 하며 피부에 부작용이 적고 항균, 항암, 항산화 등의 기능성이 있으나 재현성, 표준화의 문제점, 원료공급의 불안정성, 고가의 원료비 등 한계점이 있다. 천연색소 중 피코에리트린은 대표적인 핑크색 색소로 자연계에 존재하는 형광 물질 중 가장 밝은 핑크 색소 중 하나이다. 피코에리트린 색소를 추출하는 대표적인 방식은 홍조류인 김으로부터 에탄올 등의 유기 용매에서 추출하여야 한다. 그러나 김은 포자를 활용해 번식하는 해조류로서 다양한 포자들이 존재하고, 동일 집단의 해조류에서만 추출하기가 어려워 핑크빛 색상을 일정하게 유지 시키기가 쉽지 않은 단점을 가지고 있다. 따라서 본 연구는 단백질 재조합 기술로 피코에리트린을 발현하고 안전성 및 기능성을 살펴본 후 인공합성색소와 표면 발색을 비교분석 하여 상업적 색소로서 대체 가능성을 살펴보는 데 그 목적이 있다. 본 연구의 실험 방법으로 피코에리트린 생합성을 담당하는 Hox1, pebS, HT-cpcA, cpcE, cpcF의 cDNA 유전자와 DNA 운반체인 플라스미드(Plasmid) 벡터인 pACYCDuet1, pETDuet1, pCDFDuet1를 이용하여 대장균(E. coli)을 형질전환(Transformation) 후 피코에리트린 발현이 잘 되었는지 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 피코에리트린 단백질 발현을 확인한 뒤, 대량 배양발효기를 활용하여 배양 후 그 속에 발현된 피코에리트린을 IMAC(Immobilized metal affinity chromatography)을 통해 정제하였다. 피코에리트린의 안전성 및 기능성을 실험하기 위하여 세포독성 시험 MTT Assay를 수행한 후, 항산화 효능시험 Anti-oxidant Assay 및 미백 효능시험 Melanin inhibitory assay를 실시하였고 피코에리트린 색소와 인공합성색소를 넣은 립글로스를 제조한 뒤 분광측색계를 사용하여 L*, a*, b* 값을 비교 분석하였다. 첫째, 피코에리트린 생합성 효소와 벡터를 이용하여 재조합 기술로 피코에리트린의 발현을 유도하였으며, 대량 배양기를 통해 함수 중량을 측정한 결과 약 8.31g/L의 대장균을 수확하였다. 대장균 속 피코에리트린을 정제한 결과 대장균 군체 g당 10.06㎎의 정제 수율을 보였으며, 순도는 97.7%의 높은 순도를 나타내었다. 이렇게 추출한 피코에리트린은 자연에서 얻은 피코에리트린과 유사한 파장에서 최대 흡광을 나타내었다. 둘째, 정제된 피코에리트린에 대한 세포독성에 미치는 영향을 확인하기 위해 피부 세포주(HaCaT)를 이용한 MTT 검사를 한 결과, 세포독성은 없으며, 오히려 처리농도가 고농도일수록 세포 생존율이 높아짐을 확인하였다. 셋째, 정제된 피코에리트린에 대한 항노화 소재로서 가능성을 확인하기 위한 활성산소 제거능을 알아보기 위해 Anti-oxidant assay를 실험한 결과 고농도에서 과산화수소(H2O2) 농도가 제거되었다. 넷째, 피코에리트린의 미백 소재로서의 가능성을 확인하기 위하여 Melanin inhibitory assay를 수행한 결과, 피코에리트린이 멜라닌 합성을 농도 의존적으로 억제하여 미백 효능이 있음을 확인하였다. 다섯째, 피코에리트린의 색소로서의 제품화 가능성을 확인하기 위하여 립글로스를 제조하고, 인공합성색소를 함유한 립글로스와 표면 발색을 비교 분석한 결과 인공합성색소를 함유한 립글로스와 차이가 미비한 것으로 나타났다. 이 결과를 바탕으로 유전자재조합 기술을 응용한 피코에리트린 천연색소 단백질의 생산은 자연적으로 추출된 피코에리트린 단백질과 유사한 생산이 가능한 것을 보여주었다. 분리 정제된 피코에리트린 단백질은 피부세포 독성이 없으며, 항산화, 미백 효능을 나타내어서 단순한 천연색소를 뛰어넘어 고기능성 항노화 천연소재로서의 가능성을 시사하였다.