착상 전 생쥐 배아의 밀집화에 관련된 세포내 Ca^(2+)과 pH에 관한 연구

Abstract

포유류의 착상전 초기 배는 난할과 밀집화(compaction) 현상 그리고 포배강을 형성(cavitation)하는 분화(differentiation)과정을 거쳐 포배로 발생하게 된다. 밀집화 현상은 할구의 세포질내 다양한 성분이 극성화되어 재배열되며, 세포간 상호작용으로 세포구조의 형태적 변화가 일어난다. 본 연구는 착상 전 생쥐 배에서 밀집화 현상에 영향을 주는 protein kinase C(PKC) 활성제인 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)을 처리하여 밀집화 현상을 유도한 후 할구의 세포질내 Ca^(2+)([Ca^(2+)]i)의 농도와 pH(pHi)의 변화를 알아보고자 하였다. 이를 위해 4세포배에 PMA를 농도별로 처리하여 생쥐의 전밀집화 현상(precompaction)이 일어나는 농도를 결정한 후, fluo 3-AM을 처리한 후 공초점현미경으로 [Ca^(2+)]i의 농도를 측정하였고, pH 지시제인 SNARF 1- AM로 pHi를 측정하였다. 또한 전밀집화 현상이 일어난 세포의 핵을 Hoechst 33258으로 염색하여 배의 형태를 관찰하였다. 연구 결과 생쥐 배의 전밀집화 현상은 PMA 10nM과 100nM 처리군에서 매우 유의하게 증가하였으며(p＜0.01) Hoechst 33258로 염색하였을 때 4개의 핵이 중앙에 몰려 있음을 관찰하였다. 또한 전밀집화 현상이 유도될 때 [Ca^(2+)]i의 농도는 증가한 후 감소하였고 탈밀집화 현상(decompaction)이 일어날 때 다시 증가한 후 감소하였으며, 전밀집화 현상?? 일어날 때 할구의 세포질내 pHi가 증가되었다. 그리고 100nM PMA 처리군에서 대조군에 비해 상실배 형성이나 포배 그리고 부화율이 유의하게 낮았다(p＜0.01). 처리 후 17시간 배양 시 10nM과 100nM PMA에서 4세포배에서 발생이 억제된 경우가 대조군에 비해 유의하게 높았다(p＜0.01). 배 형태를 관찰하였을 때 배의 핵분열이 일어났지만 세포질 분열이 지연된 것을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 PMA 처리 후 착상 전 생쥐 배의 전밀집화 현상 및 탈밀집화 현상은 할구내 [Ca^(2+)]i의 농도변화와 관계가 깊으며 전밀집화 및 탈밀집화 현상이 일어나는 과정에서 Ca^(2+)의존적 PKC 활성이 변하고 이때 Na^(+)/H^(+) exchanger의 활성화로 탈분극현상(depolarization)을 유발하여 Na^(+) 및 Ca^(2+)의 증가에 의한 pH의 변화가 배의 발생에 영향을 주는 것으로 추정된다.|The early development of mammalian embryos is characterized by the phenomena such as compaction and cavitation, which lead zygotes to develop into blastulae. Compaction is, particularly, accompanied by the polarization of blstomeric surface, rearrangement of cytoplamic components, and other structural changes resulting from the interaction between blastomeres. Present study was aimed to investigate the relationship between the compaction of mouse early embryos and changes of intracellular Ca^(2+)([Ca^(2+)]_(i)) and pH(pH_(i)). To induce precompaction which is morphologically similar to the compaction, mouse 4-cell embryos were treated with various concentrations of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), a known protein kinase C activator. [Ca^(2+)]_(i) and pH_(i) were determined by using confocal laser microscope and fluorogenic compounds such as fluo 3-AM and SNARF 1-AM. Nuclear image of the embryonic blastomeres was visualized by staining with Hoechst 33258. A higher incidence of precompaction of mouse morulae was observed at 10nM and 100nM concentrations of PMA treatment (p＜0.01). Hoechst staining of precompacted embryos showed that their nuclei were centrally located in cytoplasm. During precompaction and decompaction, interestingly, [Ca^(2+)]_(i) once increased and then decreased pH_(i) also increased as embryos underwent precompaction. However, compared to the control embryos, those treated with 100nM concentration of PMA showed significant reduction of morula and blastula formation and hatching of blastula. Particularly, when 4-cell stage embryos were treated with 10nM or 100nM of PMA for 17 hr, more embryos were arrested at 4-cell stage compared to the control ones (p＜0.01). Although cytokinesis of these embryos were inhibited by PMA, however, nuclear division was observed to take place. Based upon these results, it is suggested that the changes of [Ca^(2+)]_(i) and pH_(i). might be closely related to the PMA-induced precompaction and decompaction of mouse 4-cell embryos. The changes could affect the activities of PKC and Na^(+)/H^(+) exchanger involved in the regulation of the early development.