세린 단백분해효소의 활성 탐색과 조절을 위한 화학 프로브의 개발

Abstract

노인 황반변성은 망막 황반 부위의 진행성 퇴행성 질환으로, HtrA1 세린 단백분해효소의 과도한 활성화가 주요 발병 기전이다. HtrA1은 세포외 기질을 분해하여 망막 구조를 약화시키고 비정상적인 혈관 신생을 유도해 시력 손실을 초래한다. 본 연구는 HtrA1의 활성을 선택적으로 추적하고 조절할 수 있는 활성기반 프로브를 개발하여 황반변성 진단 및 치료제 개발에 활용할 수 있는 도구를 제시하고자 하였다. 기존 LFLV-DPP 프로브의 한계를 극복하기 위해 테트라펩타이드 구조를 트라이펩타이드로 간소화하고, P1 위치에 valine, P3 위치에 phenylalanine을 고정한 뒤 P2 위치에 소수성 잔기를 도입하여 효소 선택성과 세포 투과성을 개선하였다. SPPS 기법을 통해 합성된 트라이펩타이드 기반 프로브는 기존 프로브보다 세포 투과성이 높고 IC50 값에서도 개선된 결과를 보였다. U-87 MG 세포와 HeLa 세포에서 효율적인 활성탐지 성능을 보였으며, 인간 혈청에서도 HtrA1 효소의 활성을 성공적으로 탐지하였다. 또한, 프로브의 구조를 기반으로 트라이펩타이드 형태의 저해제를 설계 및 합성하였으며, 이는 기존 LFLV-DPP 기반 저해제보다 뛰어난 억제 효과를 보였다. 특히, P2 위치에 β-cyclopropylalanyl을 도입한 프로브와 저해제가 공통적으로 가장 우수한 IC50 값을 기록하였다. 본 연구에서 개발된 트라이펩타이드 프로브와 저해제는 테트라펩타이드 대비 효소 선택성과 억제 효과가 향상되었으며, 노인 황반변성 및 퇴행성 뇌질환의 진단과 치료제 개발에 유용한 가능성을 입증하였다. 다만, 혈청 알부민과의 비특이적 결합 문제를 해결하기 위한 추가 연구가 필요하다. 이러한 연구는 효소 연구와 정밀 의료 기술의 발전에 기여할 강력한 도구를 제공하며, HtrA 단백분해효소의 선택적 탐지와 조절, 질병 관련 바이오마커 검증 및 치료제 개발을 위한 플랫폼으로 활용될 가능성을 제시한다.|Age-related macular degeneration is a progressive degenerative disease of the macular region of the retina, with hyperactivation of the HtrA1 serine protease being a key pathological mechanism. HtrA1 degrades extracellular matrix, weakening retinal structure and inducing abnormal neovascularization, leading to vision loss. This study aimed to develop an activity-based probe capable of selectively tracking and modulating HtrA1 activity, providing a tool for age-related macular degeneration diagnosis and therapeutic development. To overcome the limitations of the existing LFLV-DPP probe, the tetrapeptide structure was simplified into a tripeptide design. Valine was fixed at the P1 position and phenylalanine at the P3 position, while various hydrophobic residues were introduced at the P2 position to improve enzyme selectivity and cell permeability. The tripeptide-based probe synthesized using solid-phase peptide synthesis demonstrated superior cell permeability and improved IC50 values compared to its predecessors. The probe exhibited efficient labeling performance in HeLa and U-87 MG cells and successfully detected HtrA1 activity in human serum. Additionally, a tripeptide-based inhibitor was synthesized using the probe's structure as a template. This inhibitor exhibited greater inhibitory effects than the LFLV-DPP-derived inhibitors. The tripeptide-based probes and inhibitors developed in this study demonstrated enhanced enzyme selectivity and inhibitory efficacy, establishing their potential utility for the diagnosis and therapeutic development of age-related macular degeneration and related diseases. However, additional research is required to address the issue of non-specific binding to serum albumin. This work provides a robust tool for advancing enzyme research and precision medicine, offering a platform for selective detection and modulation of HtrA1, as well as validation of disease-related biomarkers and development of novel therapeutics.