생쥐 배아의 완만동결과 초자화동결의 비교 연구

Abstract

배아의 동결보존에 관한 연구는 1972년 Whittingham이 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 사용하여 완만동결과 완만융해로 생쥐 배아를 빙결점 이하의 온도에서 장기간 동결보존에 성공하여 산자를 탄생시킨 이후 급속히 가속화되었다. 이와 같은 생식세포 또는 배아 동결보존 기술은 과도하게 얻어지는 잉여난자의 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 일반 체외 수정술의 보조적 장치, 치료 방법의 선택, 난자 공여 시술시 공여자-수혜자의 주기 일치의 편리성, 생식기관에 치명적 영향을 주는 질환 치료 전 생식세포의 보관, 착상 전 유전 진단 시 시간적 여유의 획득, 지연적 가족계획 등에 이용할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나 동결보존된 배아의 생존율 및 발달율은 동결 시 배아의 발달단계, 항동해제의 종류, 동결 방법에 따라 서로 다른 결과를 보임으로서 발달시기와 이에 따른 최적의 동결보존 방법을 결정하는데 많은 어려움이 따른다. 본 연구에서는 체외배양에 의해 얻어진 발달단계별 생쥐 배아를 배아의 동결에 이용되고 있는 완?링염? 방법과 초자화동결 방법으로 동결하고 융해한 후 각각의 동결 방법에 따른 배아의 생존율과 발달율을 비교하여 인간 배아 동결보존의 기초 자료로 활용하고자 하였다. 생후 5~8주된 F1 hybrid 생쥐 (C57BL♀ × CBA♂) 암컷과 12주 이상된 생식능력이 있는 수컷을 사용하였다. 암컷의 복강에 각각 5 I.U의 pregnant mare's serum gonadotropin과 human chorionic gonadotropin을 48시간 간격으로 주사하여 과배란을 유도한 후 수란관으로부터 배란된 난자를 얻어 체외수정을 하였다. 수정 후 9시간 후에 전핵배아, 24시간 후 2세포기, 48시간 후 4세포기, 63시간 후 8세포기, 72시간 후 상실배, 96시간 후 포배기의 배아를 얻어 각 발달단계별 배아를 완만동결과 초자화동결Ⅰ,Ⅱ 방법으로 동결하였다가 융해한 후 각각의 방법에 따른 생존율과 발달율을 비교 조사하였다. 생존율을 조사한 실험결과 2세포기 배아를 대상으로 한 경우 초자화동결 Ⅰ과Ⅱ의 방법이 완만동결 방법 보다 높게 나타났다 (각각 100%; 100%; 91.4%). 발달율의 경우 전핵배아의 2세포기로의 발달율과 부화율에서는 완만동결과 초자화동결 Ⅰ,Ⅱ 모두가 유사한 발달율을 나타냈으나 전핵배아의 포배로의 발달율에선 초?珉?동결 Ⅱ의 방법이 76.6%로 66.0%의 완만동결 방법보다 높은 발달율을 보였다. 2세포기 배아의 포배로의 발달율에서는 초자화동결 Ⅰ의 방법이 88.8%로 완만동결의 72.6%보다 현저히 높았으나 부화율에서는 세 방법간에 차이가 없었다. 4세포기 배아의 포배로의 발달율은 초자화동결 Ⅰ,Ⅱ 방법 모두 완만동결 방법 보다 낮은 결과를 나타냈으며 (각각 69%; 69.4%; 80.5%) 부화율에 있어서는 초자화동결 Ⅰ의 방법이 완만동결 방법보다 낮은 결과를 보였다 (각각 34.9%; 57.4%). 8세포기 배아의 포배로의 발달율과 부화율은 초자화동결 Ⅰ의 방법 (84.5%)이 완만동결 (62.9%)보다 현저히 높았으며 초자화동결 Ⅱ 방법 (74.2%)도 부화율에서 완만동결 (57.1%)보다 높았다. 상실기배아의 포배로의 발달율은 초자화동결 Ⅰ의 방법이 84.4%로 69.8%의 완만동결 보다 높았다. 포배기에서는 완만동결과 비교하여 초자화동결 Ⅰ의 방법이 확장율과 부화율에서 각각 31.2% 대 57.3% 및 13.2% 대 36.0%로 유의하게 낮은 결과를 나타냈으며 초자화동결 Ⅱ의 방법에서는 41.8%로 완만동결의 36.0%와 유사한 발달율을 나타냈다. 위의 결과를 요약하면 먼저 냉동 보존된 각 시기의 배아들의 융해 후 생존율은 발?濱丙瓦? 방법에 상관없이 거의 대부분 유사하였다. 그러나 4세포기 배아의 융해 후 포배로의 발달율과 부화율은 초자화동결 Ⅰ과 Ⅱ의 방법이 완만동결 방법보다 낮았으며 포배의 융해 후 부화율도 같은 결과를 보였다. 또한 전핵기, 2세포기, 8세포기 배아와 상실배의 경우에는 발달율과 부화율에서 오히려 초자화동결 Ⅰ과Ⅱ의 방법이 완만동결 방법보다 높았다. 이상의 결과로 보아 생쥐 배아의 동결보존 후의 발달율, 부화율은 발달단계에 따라 그리고 동결방법에 따라 서로 다르다. 그러므로 생쥐 배아의 경우 발달단계에 따라 항동해제 뿐만 아니라 최적의 동결보존 방법의 선택이 고려되어야 할 것이다.|Technology for the long term preservation of gamete and embryo has been improved greatly over the past 20 years and currently is used for supporting various assisted reproductive technology. Nevertheless cryopreservation method is not perfect and still needs to be developed. This study was designed to compare the efficiency of slow freezing method with that of vitrification method for the cryopreservation of mouse embryos. Embryos were obtained from F1 hybrid mice and collected at designated developmental stages including pronuclear stage, 2-cell stage, 4-cell stage, 8-cell stage, morula stage and blastocyst stage. Embryos of each stage were frozen by three methods; Slow freezing (1.5 M propanediol and 0.1 M sucrose), Vitrification Ⅰ(1.5 M ethylene glycol followed by 5.5 M ethylene glycol and 1.0 M sucrose), Vitrification Ⅱ(10% ethylene glycol and 10% dimethyl sulfoxide followed by 20% ethylene glycol, 20% dimethyl sulfoxide and 0.5 M sucrose). After being thawed, rates of survival, development and hatching of the embryos were morphologically assessed. Results showed that survival rate of 2-cell stage embryos after cryopreservation using vitrification Ⅰor Ⅱ method was better than that of slow freezing method. However, slow freezing method resulted in a higher rate of development and hatching when 4-cell embryos were examined (80.5%, 57.4%). Although there was no difference in the developmental rate of cryopreserved pronuclear embryos to 2-cell embryos whether they were cryopreserved by slow freezing, vitrification Ⅰor Ⅱ method, development of pronuclear embryos to blastocyst was most pronounced when they were cryopreserved by vitrification Ⅱ method. Compared to the slow freezing method, 2-cell embryos cryopreserved by vitrification Ⅰ method showed better development to blastocysts. Development of 4-cell embryos to blastocysts was significantly better when they were cryopreserved by either vitrification Ⅰor Ⅱ compared to slow freezing method. Hatching rate of 4-cell embryos was greater when vitrification Ⅰor Ⅱ method rather than slow freezing method was used. Hatching rate of 8-cell stage embryos cryopreserved by either vitrification Ⅰor Ⅱ method was greater than that of embryos cryopreserved by slow freezing mthod. However, development of morulae to blastocysts was greatest when vitrification Ⅰ method was used. Interestingly, both development and hatching rates of blastocysts cryopreserved by vitrification Ⅰ method were significantly lower than that of blastocysts cryopreserved by slow freezing method, although the efficiency of vitrification Ⅱ method was comparable to that of slow freezing method. In summary, results showed that survival rate of mouse embryos after cryopreservation was similar to each other whether they were cryopreserved by either slow freezing method, vitrification Ⅰor Ⅱ method. However, slow freezing method resulted in the better development to blastocysts and hatching of mouse 4-cell embryos and hatching of blastocyst than vitrification methods. For pronuclear, 2-cell, 8-cell embryos and morulae, vitrification methods showed a better development to blastocysts and hatching than slow freezing method. Based upon these observations, it is suggested that application of cryopreservation method can be varied depending on the developmental stage of embryos while vitrification method appears to be a better choice for the cryopreservation of most cleavage stage mouse embryos.