모세관전기영동장치를 이용한 Extracellular signal-regulated kinase의 효소 활성 측정 연구

Abstract

영문초록: p. 37-38|단백질의 인산화 반응은 모든 진핵 세포 생물체 내에서 세포 반응 조절의 기본적인 기전으로써 세포의 신호 전달 체계 연구에 매우 중요한 반응이다. 신호 전달 체계에서 많이 연구되어지고 있는 Extracellular Signal-Regulated Kinase (ERK)는 세포 반응에 관여하는 중요한 조절효소 중의 하나로써 여러 가지 성장인자에 의한 신호전달에 관여하며 다양한 범위의 기질을 인식하여 세포 내에서 많은 수의 신호단백질들을 인산화시키는 역할을 한다. ERK에 의한 신호 전달 단백질의 인산화 여부에 대한 연구방법으로 기존에 쓰이던 방법은 주로 방사선 동위원소로 표지되어 있는 기질이나 에너지원을 활용한 연구법이 대부분이었으며, 세포 반응물을 Gel을 이용한 전기 영동법으로 분리하여 확인하거나, 항체를 사용하여 확인하는 방법을 주로 사용해왔다. 그러나 이러한 연구법들은 세포 내의 신호전달 기전의 연구를 용이하게는 해 주었으나, 높은 비용이나 긴 시간의 투자가 필요하고 환경오염의 우려 등 방사선 동위원소의 사용과 관련된 여러 가지 많은 문제점이 있으며 신호전달 기전의 연구는 극히 제한되는 측면이 있었다. 최근에 들어서 많이 연구되고, 사용되고 있는 모세관 전기영동법 (Capillary Electrophoresis, CE)과 매트릭스 보조된 탈착/이온화 질량분석법 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight - Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)이 여러 가지 이유에 근거하여 상당히 유용한 연구기법이다. 위 연구법들은 작은 유기 분자에서부터 핵산이나 단백질과 같은 거대 분자까지 다양한 범위의 분자들을 검출할 수 있는 획기적인 분석 시스템으로써 소량의 시료를 빠른 시간 내에 비교적 간단히 분석할 수 있다는 큰 장점을 갖고 있다. 따라서, 기존의 분석방법에 있었던 다양한 문제점을 극복하기 위한 한 방법으로 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 연구는 세포 내부의 신호전달 기전 중 효소에 의한 단백질의 인산화 반응 분석법 개발에 관한 연구로, 모세관 전기 영동법을 이용하여 ERK 효소에 의한 Myelin Basic Protein (MBP) 펩타이드의 인산화 반응을 관찰하였고 매트릭스 보조된 탈착/이온화 질량분석기를 이용하여 인산화 반응 산물의 질량을 확인하였다.|Extracellular signal-regulated kinase (ERK) is a key regulatory enzyme mediating cell responses to mitogenic stimulation and is one of the key components in linking growth factor receptor activation to serine/threonine protein phosphorylation processes. Phosphorylation reaction by ERK plays an important role in many signal transduction pathways. ERK phosphorylates numerous substrates such as MBP, microtubule-associated protein 2 (MAP2) and nuclear protein. More speciffically, MBP is a substrate commonly employed for the detection of ERK activity and contains the consensus primary sequence PRT^(97)P. In this paper, we investigated the phosphorylation reaction of MBP substrate peptides by ERK. The three different MBP substrate peptides, MBP1 (KNIVTPRTPPPSQGK), MBP2 (VPRTPGGRR) and MBP3(APRTPGGRR) were used to select the efficient substrate peptide for phosphorylation reaction by ERK. We studied the analysis of the capillary electrophoresis in order to detect the phosphorylation of MBP peptide by ERK. We also studied the condition of phosphorylation reaction such as incubation time and temperature. The results suggested that the MBP3 peptide is the most efficient substrate for phosphorylation reaction by ERK. Using MBP3 peptide, the phosphorylation reaction of MBP by ERK was monitored with both MALDI-TOF MS and CE. Our results demonstrate the feasibility of the CE method, of which is a simple and reliable technique in determining and characterizing various kinds of enzyme reaction particularly kinase enzymes.