동결 보존이 생쥐 난소 조직의 Heat shock protein 90의 발현에 미치는 영향

Abstract

난소 조직의 동결 보존은 암과 같은 질병으로 난소를 제거해야 할 여성이나 화학 또는 방사선 치료를 받아야 하는 여성에게 차후 임신 기회를 제공할 수 있는 유용한 방법으로 제시되고 있다. 그러나 동결-융해 과정에서 난소 조직은 동결보호제에 의한 세포막 지질구조의 변화, 급속한 온도 하강에 의한 세포 내 골격과 세포기능의 손상, 탈수 과정에서의 세포 소기관 손상, 그리고 삼투압 차이에 의한 세포막의 손상 등을 받게 된다. 생물체 내에는 독성 물질에 노출되거나 다양한 외부 환경변화와 같은 스트레스에 대응하여 항상성을 유지하려는 보호 기작이 있는데 그 중 하나가 heat shock protein 90 (Hsp90)이라는 단백질을 통한 기작이다. Hsp90은 외부 자극에 의해 단백질 3차 구조가 손상되었을 때, refolding되는 과정에서 단백질의 엉킴을 막아주는 역할을 한다. 따라서 동결-융해 과정을 거치며 난소 조직이 받는 자극이나 손상에 대한 보호 작용에도 Hsp90이 관여할 것으로 추론된다. 동결-융해 후 난소 조직이 손상으로부터 회복되는 과정에서 Hsp90이 작용할 것으로 보여지므로, 본 연구에서는 동결-융해 전 후 난소 조직이 받는 손상과 Hsp90 발현양의 증감을 조사하고자 하였다. 이를 위하여 ⅰ) 동결-융해 전 후의 난소 조직에서 조직학적 방법을 통하여 손상 정도를 확인하였고, ⅱ) 동결-융해 후 37℃ 배양기에서 지정된 시간동안 체외 배양하여 Hsp90 mRNA의 증감을 RT-PCR 방법으로 확인하였고, ⅲ) western blot을 통하여 Hsp90 단백질의 합성을 조사하였으며, ⅳ) 면역조직화학법(immunohistochemistry)를 통하여 조직내 Hsp90 발현을 관찰하였다. 본 연구의 결과 동결-융해 과정을 거친 난소 조직에서 정상적인 난포 (follicle)의 수가 감소함을 관찰할 수 있었다. 동결 과정을 거치지 않은 난소 조직에서 제1차 난포 (primary follicle) 중 67％, 난포강형성이전 난포 (preantral follicle) 중 62％가 정상으로 관찰되었으며, 동결 과정을 거친 난소 조직에서는 제1차 난포 중 24％, 반포강형성 이전 난포 중 15％가 정상으로 관찰되었다 (P＜0.001). 동결-융해 과정에 의한 난소 조직 내 hsp90 mRNA 발현의 변화를 조사하기 위해 동결 처리한 난소 조직과 동결 처리하지 않은 난소 조직을 각각 체외 배양 후 RT-PCR을 시행하였다. 동결-융해한 난소 조직의 체외 배양 30분 후 hsp90α mRNA 발현 양의 증가를, 60분 이후 hsp90 β mRNA 발현 양의 증가를 관찰할 수 있었다. 증가된 hsp90 mRNA의 단백질 합성을 확인하기 위하여 western blot을 실시하였다. 동결-융해한 난소 조직의 체외 배양 6시간 후 Hsp90 단백질 합성양의 증가를 확인할 수 있었다. 동결 처리하지 않은 난소 조직과 동결 처리한 난소 조직의 체외 배양 6시간 후 면역조직화학법을 실시하여 난소 조직 내에서 Hsp90의 발현 부위를 조사하였다. 동결 처리하지 않은 난소 조직이나 동결 처리한 난소 조직 모두에서, 제1차 반포와 난포강형성이전 난포의 난자 세포질 그리고 granulosa cell의 세포질에서 Hsp90이 존재함을 관찰할 수 있었다. 난포 이외에 theca cell에서도 Hsp90의 발현을 관찰할 수 있었으나, 난소의 epithelial cell에서는 Hsp90이 거의 발현이 되지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과들을 종합하여 볼 때, 난소 조직은 동결-융해 과정을 통하여 다양한 손상을 입으며, 이 과정에서 받는 외부적인 자극과 스트레스에 의해 Hsp90 단백질의 발현 양이 증가되고, 증가된 Hsp90 단백질은 동결-융해에서 받는 손상에 대한 보호 작용과 관련이 있을것으로 사료된다.|All organism exposed to environmental stress conditions share a common molecular response characterized by a dramatic change in the pattern of gene expression followed by an elevated synthesis of heat shock proteins(HSPs). These proteins function as molecular chaperones to protect cells from environmental stress damage by binding to partially denatured proteins, dissociating protein aggregates, and regulating the correct folding and intracellular translocation of newly synthesized polypeptides. Young women who are planning to have chemotherapy and radiotherapy or to undergo bilateral oophorectomy, will suffer premature ovarian menopause and loss of fertility. In this context, cryopreservation of ovarian tissue would be advantageous in the management of human infertility. As a matter of fact, the ovarian tissue could be damaged by low temperature and osmotic shock during cryopreservation procedure. So one can postulate that a self-protection mechanism initiated by HSP will be operated in the ovarian tissue to cope with such dangerous situation. However, the expression of HSP in the cryopreserved ovarian tissue has not been proved yet. The present study was carried out to investigate the effect of cryopreservation on the expression of HSP in mouse ovarian tissue. Following experimental techniques were employed to fullfil the goal; ⅰ) histological observation, ⅱ) reverse transcription-polymerase chain reactions(RT-PCRs), ⅲ) western bolt analysis, and ⅳ) immunohistochemistry. The munger of normal follicles declined in mouse ovarian tissue after freezing and thawing. The percentages of normal primary and preantral follicles were 67％ and 62％ in the fresh ovarian tissue, but those were 24％ and 15％ in cryopreserved ovarian tissue, respectively. RT-PCR study revealed that the two subunits of HSP90(hsp90 α and hsp90 β) were expressed in both fresh and cryopreserved mouse ovarian tissue. The amount of hsp90 α and hsp90 β mRNA was increased in cryopreserved ovarian tissue after 30 minutes and 1 hour of incubation in vitro, respectively. Using western blot analysis, HSP90 proteins of cultured mouse ovarian tissue was investigate; the amount of HSP90 protein was increased in the cryopreserved ovarian tissue after 6 hours of incubation. In immunohistochemical study, HSP90 was localized in cytoplasm of oocyte and granulosa cell from primary follicles and preantral follicles of fresh or cryopreserved ovarian tissue cultured 6 hours. Significant level of immunoreactive HSP90 was detected in theca cells while the only traceable amount was found in ovarian epithelial cells. In conclusion, the present study demonstrates the expression and increasement of HSP90 in the cryopresrved mouse ovarian tissue, suggesting that HSP90 may play a role in the protective and/or recovery mechanism against the damaged caused by cryopreservaion.