단백분해효소의 활성과 퇴행성 뇌질환간의 상관관계 연구

Abstract

In this study, fluorescent substrates and cyclic probes were synthesized to identify and explore various biochemical pathways of HTRA (High Temperature Requirement A serine protease), an important regulator of physiological processes. First, a fluorescent substrate targeting HTRA was synthesized. In a previous study, we developed an active-based probe that selectively targets HTRA family proteolytic enzymes including HTRA1, HTRA2, and DegP. In this study, we attached 7-amino-4-methyl coumarin to the previously reported tetrapeptide to generate novel fluorogenic substrate. Second, after differentiating the neuroblastoma cell lines SK-N-SH and SH-SY5Y into neuron-like cells through ATRA treatment, changes in HTRA levels in the two cells were observed through SDS-PAGE using a second-generation fluorescent probe that selectively targets HTRA. Third, a library of cyclic activity-based probe targeting HTRA was synthesized. Previous studies included non-natural amino acids for optimization, and although this probe has a small mass, high cell permeability and excellent selectivity, non-specific bindings with serum proteins were observed in samples concentrated with high protein concentrations. Cyclodepsipeptide is a type of peptide that exhibits strong inhibitory properties against serine proteases, and strong HTRA inhibitors based on this structure have been reported. In this work, we designed and synthesized cyclic activity-based probes based on the sequences of the reported cyclodepsipeptides to increase sensitivity and stability of HTRA probes.|본 연구에서는 생리학적 과정의 중요한 조절자인 단백 분해 효소인 HTRA (High temperature requirement A serine protease)의 다양한 생화학적 경로를 확인 탐색하고자 이를 타겟으로 하는 형광 기질 및 cyclic probe를 합성하였다. 첫째, HTRA를 타겟으로 하는 형광 기질을 합성하였다. 이전 연구에서 HTRA1, HTRA2 및 DegP를 포함한 HTRA 계열의 단백질 가수 분해 효소를 선택적으로 표적화하는 활성 기반 프로브를 개발하였는데, 이번 연구에서는 기존의 프로브 peptide sequence를 참고하여 Fluorescent tags 였던 fluorescein 대신 coumarin derivative인 7-Amino-4-methylcoumarin을 부착하여 기존의 HTRA의 활성 측정을 위한 substrate로 사용되고 있는 시판중인 기질인 H2-OTP에 비해 분자량이 작은 형광 기질을 합성하고 에세이를 통해 효소-기질 반응을 관찰하였다. 둘째, neuroblastoma cell line인 SK-N-SH와 SH-SY5Y에서 ATRA 처리를 통해 neuron-like 세포로 분화 시킨 뒤 두 세포에서의 HTRA의 수준 변화를 HTRA계열의 단백질 가수 분해 효소를 선택적으로 표지하는 2세대 형광 프로브를 이용하여 SDS-PAGE와 광학영상을 통해 관찰하였다. 셋째, HTRA를 타겟으로 하는 cyclic activity-based probe를 합성하였다. 이전 연구에서는 최적화를 위해 비천연 아미노산을 포함하였고 이 프로브는 질량이 작아 세포 투과도가 높고 선택성이 우수하나 단백질이 고농도로 농축된 시료의 경우 혈장단백질과의 비특이적 반응이 관찰되었다. Cyclodepsipeptide는 serine protease에 강력한 억제 특성을 나타내는 펩티드 종류이며 이러한 구조를 기반으로 한 강력한 HTRA 저해제가 보고된 바 있어 이와 유사한 구조의 cyclic probe를 합성하여 감도와 안정성을 높이고자 하였다.