나노 하이드록시어파타이트의 합성과 프로테아제 고정화 지지체로서의 응용

Abstract

논 문 개 요

하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)는 뼈의 주된 구성 성분으로서 환경친화적이고 생체친화적이기 때문에, 많은 생명공학적인 응용에 활용되고 연구되어 왔다. 이러한 하이드록시아파타이트의 응용연구와 함께 하이드록시아파타이트의 제조법에 관한 연구 역시 연구자들의 주된 관심사이다. 그렇지만, 하이드록시아파타이트의 합성에 있어서 대부분의 경우 오랜 시간이 요구되는 하소과정(煆燒, calcination)이 포함된다. 본 연구에서는 이러한 하소과정이 생략된 보다 간편하고 빠른 시간 안에 하이드록시아파타이트를 제조하는 방법을 개발하였고, 하이드록시아파타이트를 활용하여 단백질 가수분해 효소인 subtilisin의 고정화를 통해 유기용매 하의 반응성을 향상시켰다.

먼저, 하이드록시아파타이트는 하소과정과 특별한 주형(template)화합물 없이, 마이크로웨이브의 조사를 통해 짧은 시간 안에 합성되었다. 합성된 하이드록시아파타이트는 SEM 분석에 의해 나노크기의 막대모양을 지니고 있음이 확인되었다. 그리고 XRD, IR 분석에 의해 기존에 알려진 하이드록시아파타이트의 구조와 동일한 것으로 확인되었다. 하이드록시아파타이트의 생명공학적 응용성을 확대하기 위해서, 하이드록시아파타이트 합성 시에 아미노산을 첨가한 결과, 기존 하소과정이 포함된 합성방법으로는 생성하기 불가능했던 아미노산이 표면에 결합된 하이드록시아파타이트를 얻을 수 있었다. 결합된 아미노산의 존재는 강산으로 분해된 아미노산-하이드록시아파타이트의 시료를 NMR 분석을 통해 확인하였다.

리파제와 함께, 광화학적으로 순수한 이차 알코올을 합성하는데 활용되는 subtilisin은 리파제와 달리 유기용매 하에서 그 반응성이 현저히 감소된다. 따라서 연구자들은 subtilisin의 유기용매 하에서의 반응성을 향상시키기 위해 시도하여 왔다. 본 연구에서는 subtilisin의 표면이 극성임에 착안하여, 극성표면을 지닌 하이드록시아파타이트를 고정화용 지지체로 사용하면, 이들 간의 긍정적인 상호작용을 할 수 있을 것으로 기대하였고, 결과적으로 subtilisin의 유기용매 하에서 반응성이 향상될 것으로 기대하였다. 기대와 마찬가지로, 하이드록시아파타이트와 함께 동결건조된 subtilisin은 1-phenylethanol과 vinyl butyrate의 반응에서 1000배 이상의 반응성 향상을 보여주었다. 이 결과는 하이드록시아파타이트가 subtilisin의 고정화 지지체로 효과적으로 활용될 수 있음을 보여준다.

|Hydroxyapatite is a main component of natural bone systems, and it is eco-friendly and biocompatible. Researchers have utilized and studied in many bio-applications of hydroxyapatite. In addition, the development of the synthetic methods of hydroxyapatite has also been actively studied. Most synthetic methods include a calcination process, which requires a long period of time and large energy consumption. This thesis deals with a synthetic method of hydroxyapatite in a simple way and for a short period of time, and a utilization for improving the reactivity of subtilisin, which possesses low chemo-tolerance, in organic solvents. First, hydroxyapatite was synthesized by microwave irradiation for 90 min without a calcination process and any template compounds. SEM analyses revealed that the morphology of the synthesized hydroxyapatite is nano-sized rod with about 150 nm in length and about 20 nm in width. XRD and IR analyses exhibited the patterns of the synthesized hydroxyapatite are identical with those of the commercial hydroxyapatite. In addition, amino-acid decorated hydroxyapatite was synthesized by addition of amino acids during microwave-irradiation synthesis to expand the bio-application of hydroxyapatite. The presence of the amino acid on the surface was confirmed by NMR analysis with a sample of amino acid-hydroxyapatite degraded by strong acid. Second, hydroxyapatite was used to improve the activity of subtilisin in organic solvents. Subtilisin is commonly used in the kinetic resolution of chiral sec-alcohols. However, the activity of subtilisin significantly decreases in organic solvents. Therefore, researchers have attempted to improve the reactivity of subtilisin in organic solvents. In this study, it is hypothesized that the charged surface of hydroxyapatite can construct positive interactions with the polar surface of subtilisin, and thus the positive interactions may stabilize subtilisin in organic solvents. As expected, the reactivity of subtilisin lyophilized with hydroxyapatite exhibited a dramatic improvement up to 1000 fold in the reaction of 1-phenylethanol with vinyl butyrate. These results indicates that hydroxyapatite can be efficiently used as an immobilization supporting material for subtilisin.