The roles of KROX-24 in ovulation in mouse

Abstract

Folliculogenesis are regulated by gonadotropins, steroid hormones and auto-/paracrine factors, selective matured oocyte was progressed the ovulation. The ovulation cause it to be expressed protease, immuno-cellular regulatory molecule and immune factors crowd specific ovulated site by luteinizing hormone (LH), however many factors unknown. Using the DNA microarray methodology to identified time specific and tissue specific expressed gene in ovary after LH surge to before ovulation.We identified to related gene with ovulation among time specific expressed gene after LH surge. Krox-24 well known to regulated formation of follicles-regulated hormone in pituitary. Through the microarray, we identified the relative gene of Krox-24 expressed at ovulation specific. In this study, we tried to know about the actual state of Krox-24 with the various experimental methods in folliculogenesis and after ovulation. Krox-24 expression in ovary after LH surge dramatically increased, it confirmed to microarray data. In histological study, the pool of follicles was dramatically reduced in Krox-24 KO mice (8 months old). And these ovaries didn’t observed growing follicles and some follicles accumulated with blood. Wild-type mice have a rhythmical change every 4~5days. But Krox-24 KO mice have irregular cycle and always have diestrus stage. We experimented to roles of the ovulation and overcome of defect of pituitary using artificially induction of LH. The numbers of ovulated oocyte or punctured oocyte were significantly reduced compared to control group in Krox-24 KO mice. Krox-24 gene highly expressed at 2~4 hrs after hCG injection in granulose cell in ovary. We determinated to expression pattern of a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS-1) and tissue growth factor-β (TGFβ). Also, ADAMTS-1 was well known to PR downstream gene, we analyzed PR expression regulation by Krox-24 using the PCR or in silico way. ADAMTS-1are expressed at 12 hr after hCG injection, but TGFβ was expressed all stage post hCG injection and PR was expressed at 4~6 hrs after hCG injection. While observed expression of ADAMTS-1 at 12 hr hCG injection, PR is expressed at all stage in Krox-24 KO mice. Using in silico way the ER binding domain and Krox-24 binding domain could found in PR promoter region. From these results it is suggested that Krox-24 are work in successful ovulation and folliculogenesis in mice ovary. In addition Krox-24 may regulate ovulation through PR downstream including ADAMTS-1 or TGFβ. |난포형성 (folliculogenesis)은 성선자극호르몬, 스테로이드 호르몬, 자가-타가 조절요인의 조절을 통하여 진행되며, 궁극에 가서는 선택된 성숙난포에서 난자의 배란이 진행된다. 배란은 황체화 호르몬 (LH)에 의해난포세포에서 발현되는 단백질 분해효소, 면역세포조절물질 그리고 배란이 진행될 특정부위로 모이는 면역관련 세포들에 의해 진행되는 것으로 알려져 왔으나, 아직 많은 부분이 밝혀져 있지 않다. 따라서 황체화 호르몬 급증 이후 난자가 배란 되기까지 시기 특이적이고, 조직 특이적으로 난소에서 발현되는 유전자를 동정하기 위하여 DNA microarray 방법을 이용하였다. 황체화 호르몬급증 이후 시기 특이적으로 발현되는 유전자 중 배란과 관련된 유전자로 기대되는 유전자를 microarray 결과와 알려진 생물학적 기능을 근거로 하여 동정하였다. 그 중 Krox-24는 전사조절 인자로 뇌하수체에서 황체화 호르몬을 생성하는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 본 연구에서는 난포형성과 배란에 있어서 Krox-24가 어떠한 역할을 할 것인가를 다양한 실험방법을 이용하여 알아보고자 하였다. 생쥐 난소의 Microarray data 결과와 동일하게 RT-PCR을 이용한 분석에서도 Krox-24는 RT-PCR에서 황체화 호르몬 주사 후 hCG 주사 후 시기 특이적으로 2~4시간대에 난소에서 발현 양이 급증하였다. 조직학적 분석에서 10개월 이상 된 Krox-24 형질전환 생쥐의 난소에서는 난포가 거의 없었으며 관찰된 난포는 혈액이 고이거나 또는 비정상적 형태를 보였다. 생식주기가 4~5일 단위로 규칙적으로 진행을 보인 대조군 생쥐와 달리 Krox-24 형질전환 생쥐에서는 주기적 변화가 관찰되지 않고 비발정(diestrus) 상태가 지속되었다. 황체화 호르몬을 인위적으로 주어 Krox-24 형질전환 생쥐의 뇌하수체에서의 문제점을 극복하고 배란에서의 역할을 알아보았다. 난포자극 호르몬 (FSH)과 황체화 호르몬을 이용한과배란 유도 실험에서 배란 전 난자의 수가 대조군에 비하여 유의하게 감소하였고, 난구세포 (cumulus)가 군데군데 엉킨 건강하지 않은 팽창 양상을 보였다. 또한 hCG 주사 후 배란이 진행 된 시간 이후 난소 조직 절편에서 난자가 배란되지 못하고 난포 내에 갇혀 있는 것을 확인할 수 있었다. Krox-24와 이 유전자에 의해서 조절되는 것으로 알려진 a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS-1)와 tissue growth factor-β (TGFβ)의 배란 전후 발현 양을 알아보고자 RT-PCR을 수행하였다. 대조군에서 Krox-24는 hCG 주사 후 2~4시간째, ADAMTS-1은 12시간째, TGFβ는 모든 실험 시점에서 발현하였다. 그러나 Krox-24 형질전환 생쥐에서는 ADAMTS-1은 hCG 주사 후 9, 12, 15시간에 강하게 발현하였다. 또한 ADAMTS-1 은 프로게스테론 수용체 (PR) 하부 및 다른 조직에서 Krox-24의 하부 유전자로 알려져 있어 Krox-24에 의한 프로게스테론 수용체의 발현 조절 가능성을 in silico 방법을 이용한 프로모터 (promoter)부위 분석을 통하여 추정하였다. 프로게스테론 수용체는 hCG 주사 후 4시간째에 강하게 발현하였는데, 형질전환 생쥐에서는 모든 시기에서 발현하였다. 프로게스테론 수용체의 프로모터 부위에 Krox-24 결합 부위 (binding domain)을 찾을 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 Krox-24는 난포형성과정에서 난자-난구복합체의 정상적 분화에 관여할 것으로 추정된다. 또한 Krox-24는 프로게스테론 수용체를 매개로 ADAMTS-1 등의 하부 유전자 발현조절을 통하여 배란 조절에서 중요한 역할을 수행할 것을 알 수 있었다.