The Expression and Role of Anti-Müllerian Hormone during Implantation of Mouse Embryo

Abstract

배아가 착상하는 동안 자궁내막은 임신 유지와 모체 보호를 위한 형태적, 기능적인 변화를 수반한다. 이러한 변화는 세포의 증식, 분화, 사멸과 같은 생물학적 현상을 수반하며, 배아가 착상하는데 가장 좋은 환경을 만들기 위하여 꼭 필요한 과정으로 탈락막 과정이라고 한다. 이 과정 동안 배아를 둘러싼 기질세포는 탈락막 세포로 분화하며 모체와 배아 사이의 물리적인 상호작용에서 중요한 역할을 한다. 탈락막 과정은 난소호르몬인 에스트로겐과 프로게스테론에 의해서 조절 되며 또한 사이토카인과 성장인자 등에 의해 영향을 받는다. 특히 transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily 의 구성원인 inhibin, activin, TGF-β, born morphogenetic proteins (BMP) 등은 이 시기에 중요한 역할을 한다고 알려져 왔다. TGF-β superfamily 의 구성원이며 수컷 태아에서 Müllerian ducts 의 퇴화를 유도하는 것으로 잘 알려져 있는 anti-Müllerian hormone (AMH) 은 자궁내막세포에서도 발현됨이 보고 되고 있다. 그러나 아직까지 자궁에서의 역할 특히, 임신과 관련하여 알려진 바가 미미하다. 따라서 본 연구에서는 생쥐 배아의 착상기간 동안 자궁에서의 Amh와 수용체인 anti-Müllerian hormone receptor II (Amhr2) 가 발현되는지 알아 보았고, 탈락막 과정과 관련 하여 어떠한 기능이 있는지 살펴 보았다. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 을 통해 분석한 결과, 착상 이전인 임신 1, 2, 3, 4일째의 자궁내막조직에서는 Amh와 Amhr2 mRNA 가 기저수준으로 발현되는 반면 탈락막 과정이 일어나고 배아가 착상하는 임신 5일 이후에는 유의성 있게 증가하는 양상을 보였다. 한편 탈락막이 쇠퇴하는 시기인 9, 12일에는 발현이 급격하게 감소하였다. AMH와 AMHRII 단백질 발현도 임신 시기 동안 관찰되는 이들 유전자 발현과 동일하게 탈락막의 형성과 쇠퇴 양상과 일치하였다. AMH 단백질은 착상전인 1, 2, 3일에는 상피세포에 표지되고, 착상시기인 4, 5일에는 상피세포와 기질세포 모두에서 표지되었다. 탈락막 반응이 진행된 이후 배아를 둘러싼 1차 탈락막 세포에 주로 표지되고 탈락막 반응이 진행되지 않은 세포에서는 발현되지 않았다. 탈락막이 소실되고 태반이 나타나는 시기에는 태반이 형성되는 부위에 약하게 표지되었다. 한편 AMHRII 단백질은 1, 2, 3, 4, 5일째의 자궁내막조직의 상피세포에서는 발현되지 않고 기질세포에서만 발현되었고 4, 5일에 좀더 강하게 발현되었다. 탈락막 반응이 왕성하게 진행되는 임신 7일째에는 1차 탈락막 세포와 자궁근층에 접해있는 기질세포에서 강하게 발현되었다. 9, 12일에는 mesometrial 부위의 기질에 표지되었다. 체외에서 탈락막 반응을 E2와 P4를 처리하여 유도 할 경우 대조군에 비하여 재조합 AMH를 처리 한 실험군에서의 자궁내막세포의 수가 유의하게 적었고 핵분열 비율도 적었다. 또한 탈락막 세포로 분화하는 비율도 상대적으로 적었다. 이러한 결과를 바탕으로 탈락막 반응이 진행되는 시기에 AMH가 autocrine /paracrine factor로 기질세포의 증식을 조절하고 착상 이후에는 자궁근층에 접해있는 기질세포의 증식과 분화를 조절하는 것으로 추정 할 수 있다.|During implantation, endometrial cells undergo functional and structural changes including proliferation, differentiation and apoptosis. This reaction is known as decidualization and is critical to support the implantation and nutrition of implanting embryo, and to prevent the uterine functions. This delicate progress is achieved by complex communication of regulators such as hormones, cytokines, and growth factors. Inhibins, activins, TGF-βs, and born morphogenetic proteins (BMP) are part of TGF- β superfamily and involve in uterine modulation during pregnancy. Anti-Müllerian hormone (AMH) is a member of TGF- β superfamily. It`s role in the sexual differentiation of male fetus is now well known. Recently it is revealed that the expression of Amh in endometrium of both nonpregnant and pregnant rat uterus, but the role is not unexplored in pregnancy. The present study was aimed to investigate the profile of AMH expression and the role at the time of implantation. For that quantitative real-time PCR technology, Western blotting methodology, immunohistochemistry method, immunofluorescence method and in vitro decidualization-induction technology were employed. Amh and Amhr2 specific mRNAs were detected from day 1 of pregnancy but its level is very low. At the time of implantation their level was dramatically increased until day 7 of pregnancy and then decreased until day 12 of pregnancy. The levels of AMH and AMHRII proteins in the pregnant uteri were same with that of their mRNA levels. AMH localized in the epithelium until day 3 of pregnancy and then detected both in epithelium and stroma. AMH protein was detected in the luminal and glandular epithelial cells and stromal cells on day 4 and 5. On day 7, AMH protein was detected in the decidualized cells surrounding the embryo. Its specific signals were not detected in nondecidual cells. On the other hand, AMHRII protein was only detected in the stromal cells in all the physiological status. After implantation, it was localized in the decidualized cells surrounding the embryos and in the deep stromal cells adjacent to the myometrium. Placenta-differentiating area was showed weak signals. Using in vitro primary endometrial stromal cell culture model, the functional role was analyzed. The number of cells was less and mitotic ratio was decreased by rhAMH. These groups also were decreased differentiation from stroma cell to decidual cell. Put together, it is cleared that AMH regulate the mitotic division and cytokinesis through its receptor. In addition AMH suppress the decidual differentiation of stroma cell during deciudalization period in mouse.