Studies on functional properties of monoclonal antibodies elicited by DENV EDIII recombinant proteins

Abstract

Approximately 400 million people worldwide are infected annually with dengue virus (DENV). DENV includes four serotypes (1-4). Most DENV infections are asymptomatic, but sometimes severe manifestations, such as dengue hemorrhagic fever (DHF), dengue fever (DF), and dengue shock syndrome (DSS), occur during secondary heterologous infections, due to antibody dependent enhancement (ADE). With the acceleration of global warming, the number of mosquitoes is increasing worldwide. There is no therapeutic agent for DENV, and the recently approved vaccine has limitations due to side effects. Therefore, it is necessary to develop an efficient tetravalent vaccine. In this study, the functional properties of the monoclonal antibodies (mAbs) elicited by soluble DENV E protein domain III (EDIII) recombinant proteins were identified. The soluble human RNA-interacting domain (hRID)-DENV EDIII recombinant fusion proteins were expressed as antigens in E. coli , and then 29 DENV EDIII mAbs against the four serotypes of DENV were generated. DENV EDIII overlapping peptides were synthesized, and mAb binding activity was confirmed via enzyme-linked immunosorbent assay. Neutralizing activity of the mAbs was then tested using a microneutralization test. Binding activity and neutralizing activity occurred independently of each other. Although binding activity was not shown, neutralizing activity still occurred for various reasons. We confirmed that the interaction between mAb 8G6 and peptides 2-12 and 2-13 represented potential neutralizing activity and binding activity. Furthermore, mAb 12D7 exhibited broad-spectrum antiviral activity.|매년, 전 세계적으로 약 4억 명의 사람들이 뎅기바이러스에 감염된다. 뎅기바이러스는 1형부터 4형까지 네 가지 혈청형을 가지며 뎅기바이러스의 감염은 대부분 무증상 또는 미약한 증상을 보이지만, 다른 혈청형에 의한 두번째 감염은 항체의존면역증강 (antibody-dependent enhancement)을 발생시키는 특성을 가지고 있다. 이로 인해 중증 뎅기열 (dengue fever), 뎅기 출혈열 (dengue hemorrhagic fever), 뎅기 쇼크 증후군 (dengue shock syndrome)등의 심각한 증상을 일으키며 사망에 이를 수 있다. 뎅기바이러스는 주로 열대지방과 아열대 지방에서 많이 발생한다. 그러나 최근에는 지구온난화의 가속화로 인하여 모기의 서식지가 증가함에 따라 뎅기열 발병 또한 증가하고 있는 추세이다. 현재 뎅기바이러스에 특이적으로 작용하는 치료제는 없으며, 2019년 FDA의 승인을 받은 뎅기바이러스 백신, Dengvaxia, 역시 부작용으로 인한 사용의 한계가 있다. 그러므로 여전히 뎅기바이러스의 네가지 혈청형을 모두 예방할 수 있는 백신 또는 치료제의 개발이 필요한 상황이다. 이 연구에서는, E. coli 발현 시스템을 이용하여 뎅기바이러스 재조합단백질 항원을 수용성의 형태로 발현하였고, 이를 이용하여 뎅기바이러스의 단클론항체를 생산한 후 이들의 특성을 확인하였다. 수용성 재조합 단백질을 생산하는 과정에서, E. coli 발현 시스템 내의 적절한 단백질의 번역 후 변형 (post translational modification) 과정을 수행하기 위하여 타겟 단백질에 human RNA-interacting domain (hRID)을 융합한 hRID-DENV EDIII 재조합 융합 단백질을 이용하였으며, 하이브리도마 기술을 이용하여 각 혈청형 별 단클론항체를 생산하였다. 또한 에피토프 매핑을 위한 뎅기바이러스 E protein domain III (EDIII)의 펩타이드 라이브러리를 합성하였다. 효소면역분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 에피토프 매핑을 진행하였으며, microneutralization test를 이용하여 각 혈청형의 뎅기바이러스에 대한 단클론항체의 중화능을 확인하였다. 결과적으로, 단클론항체와 EDIII 펩타이드가 상당한 결합력을 나타냄에도, 뎅기바이러스의 EDIII만을 타겟하는 단클론항체는 대체적으로 중화능이 부족함을 확인하였으며, 반대로 단클론항체와 EDIII 펩타이드가 결합력을 보이지 않음에도 불구하고 몇몇 단클론항체는 뎅기바이러스에 대한 중화능을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 2형 뎅기바이러스의 단클론항체 8G6 과 펩타이드 2-12 와 2-13 간의 결합력과 중화능은 모두 상당한 효과를 나타냈으며, 펩타이드 2-12 와 2-13은 단클론항체 8G6의 핵심 중화 에피토프 일 것 이라고 추측한다. 뎅기바이러스 4형의 단클론항체 12D7은 뎅기바이러스 네 가지 혈청형 모두에 중화능을 보이는 광범위 항바이러스 효과 (broad-spectrum antiviral activity)를 확인하였다.