Rational approach for improving enantioselectivity and altering reaction mechanism of hydrolases

Abstract

Enzymes are efficient catalysts for a wide range of industrial applications because of their high reactivity and selectivity. In addition, enzymatic reactions are environmentally benign and are performed under mild conditions. Due to these characteristics of enzymes, industrial applications of enzymes become much more important. However, many enzymes do not show enough reactivity, stability, and selectivity toward unnatural substrates under process conditions. To overcome these problems, researchers have attempted to find new enzymes from nature or modified enzymes by chemical or molecular biological approaches. This thesis deals with biological approaches to alter the functionality of hydrolases. The first study in this thesis was performed to increase the enantioselectivity of an enzyme by molecular biological approach. Enantiopure tetrahydrofuran-2-carboxylate (THFC) is an important intermediate in the pharmaceutical industry and research. We have increased the enantioselectivity of CAL-B (lipase B from Candida antarctica) towards butyl tetrahydrofuran-2-carboxylate. We introduced residues to construct a hydrogen bond or repulsive interaction with the oxygen atom of THFC. Several mutants showed not only higher enantioselectivity but also reverse enantio-preference compared to the wild- type enzyme. In organic solvent, E value of I189D was 3.0 and R-selective while the wild-type enzyme had 1.9 of the E-value and S-selectivity. And most enzyme variants showed higher enantioselectivity in organic solvents than in aqueous media. In the second study, modification of an enzyme to introduce new enzyme function was investigated. Our goal was to introduce a peroxidase activity to PerPA (perhydrolase from Pseudomonas aeruginosa). For this, we first chose several residues near the active site to accept a metal ion by molecular modeling. Then we have introduced histidine and glutamate/aspartate to bind a metal ion by protein engineering. The F165/L32E mutant (specific activity: 8.9 x 10^(-4) μmol · sec^(-1) · mg^(-1)) showed 100-fold increased peroxidase activity compared to the wild-type enzyme (specific activity: 8.4 x 10^(-6) μmol · sec^(-1) · mg^(-1)).|효소는 높은 반응성과 선택성을 가지므로, 여러 합성 중간체로 사용되는 키랄 아민, 키랄 에스터, 키랄 알코올 등을 효율적으로 제조하는 데 활용되어 왔다. 많은 경우 효소는 광범위한 기질 특이성을 가지므로 다양한 종류의 반응에 응용될 수 있으며, 그 반응 조건이 온화하고, 환경 친화적인 장점을 가지고 있다. 이러한 효소의 장점에 기인하여, 청정화학이 중요시 되고 있는 최근에는 효소의 산업적 이용이 더욱 중요시 되고 있다. 그러나 효소는 경우에 따라 비천연화합물에 대한 충분한 선택성이나 반응성을 보이지 않으므로, 산업적으로 보다 효과적인 활용에 어려움이 있다. 연구자들은 이러한 문제점을 해결하기 위해 자연계에서 새로운 효소를 찾거나, 기존에 알려진 효소를 이용하여 화학적 혹은 분자생물학적 접근방법을 통해 효소의 선택성 혹은 반응성을 향상하려는 노력을 해왔다. 본 논문에서는 분자생물학적 접근방법을 통하여 효소의 기능을 변화시키는 연구를 다루었다. 본 논문에서는 첫 번째로 분자생물학적 방법을 활용하여 기존의 효소가 보이는 기질에 대한 입체선택성을 높이는 연구를 다루었다. 광학적으로 순수한 tetrahydrofuran-2-carboxylate (THFC)는 의약 산업 및 연구에 있어서 중요한 중간체이다. 본 연구에서는 단백질 조작을 통해 얻은 CAL-B 라는 Candida antarctica에서 추출된 lipase의 변형체들을 이용하여 THFC의 산소원자와 수소결합을 하거나 또는 반발력을 유발하도록 디자인되었다. 효소변형체들 중 일부는 wild type 보다 높은 입체선택성을 보였고, 반대되는 입체 선호도를 보였다. 유기용매에서는 I189D 변형체가 wild type보다 높은 입체선택성 (I189D, E = 3.0; wild type, E = 1.9)을 보였으며, 반대되는 입체선호도(I189D = R; wild type = S)를 보였다. 수용액에서는 I189S 변형체가 wild type보다 높은 입체선택성 (I189S, E = 2.2; wild type, E = 1.3)을 보였다. 그리고 대부분의 효소 변형체들은 수용액보다 유기용매에서 최대 1.6배 증가된 입체 선택성을 보였다. 두 번째로, 본 논문은 분자생물학적 방법을 활용하여 효소의 선천적인 반응성과는 다른 새로운 반응성을 도입시키는 연구를 다루었다. 본 연구는 PerPA (perhydrolase from Pseudomonas aeruginosa) 효소 내부에 금속이온이 결합할 수 있는 효소변형체를 생산함으로써 산화반응성을 도입시키는 것을 목적으로 하였다. 이를 위하여, 먼저 분자모델링을 통하여 반응 중심에 금속이온이 결합 가능한 위치를 선정하였다. 그리고 분자생물학적인 방법을 통하여 금속이온과 결합할 수 있는 히스티딘과 글루탐산/아스파르트산을 도입하였다. 생성된 효소변형체들 중 F165H/L32E 변형체 (specific activity: 8.9 × 10^(-4)μmol · sec^(-1) · mg^(-1))는 wild type (specific activity: 8.4 × 10^(-6) μmol · sec^(-1) ·mg^(-1))과 나머지 효소변형체들에 비해 100배 높은 산화반응성을 보였다.