Possible roles of Sirtuin 1 in decidualization of mouse uterus

Abstract

배아의 착상은 배아와 자궁내막 사이에서 일어나는 복잡한 과정이다. 착상시기 동안 자궁내막은 조직학적, 기능적 변화를 겪는다. 세포 외 표지들은 미세 환경을 유지하는 핵심 물질이다. 또한 배아 착상과 배반포의 발달을 지지한다. 탈락막화된 조직은 수용성을 가지고 침입하는 영양세포를 엄격하게 통제한다. Sirtuin 단백질(SIRT) 계열은 신경변성, 암 성장, 노화와 관련된 결함, 그리고 비만을 포함한 생리적 및 다양한 병리학적 과정에 관여하는 SIRT1~7이다. Sirtuin 계열의 가장 중요한 구성원 중 하나인 SIRT1은 지난 몇 년간 특히 암생물학에서 연구되었다. SIRT1의 기능은 종양의 성장에 억제제 또는 촉진제 역할을 할 수 있기 때문에 여전히 논란이 있다. 또한 SIRT1은 여성 생식계에서 흥미로운 표적 유전자였다. 이전의 연구들의 결과에서 보여 준 바와 같이 인간과 개코원숭이의 자궁내막증에서 유의미한 SIRT1 상향조절을 확인했기 때문이다. 이러한 결과는 적절한 SIRT1 조절이 건강한 여성 생식계에 중요하다는 것을 시사한다. 그러나 자궁에서 SIRT1의 기능은 직접적으로 연구되지 않았다. 여기서 면역조직화학 분석을 사용한 자궁 특이적 Sirt1은 생쥐에서 임신 초기 내내 SIRT1 발현을 보였으며, 결정화 세포에서 GD4.5와 GD5.5에서 가장 강하게 발현되는 것으로 나타났다. 6개월 간의 임신 시험 결과, Sirt1d/d 암컷은 난임이며, 새끼를 낳는 횟수가 현저히 감소하였다(n=5, *p<0.05). GD 3.5에서 Sirt1d/d 자궁에서 수집된 배아의 수는 대조군과 차이가 없었으며 Progesterone 과 Estrogen의 수준 또한 대조군과 유의적인 차이가 없었다. 따라서 Sirt1d/d 은 정상적인 난소 기능을 나타냈다. 그러나 Sirt1d/d 생쥐에서는 GD5.5 (p < 0.05)의 착상부위 수가 대조군에 비해 유의하게 감소했다. 착상 결손의 원인을 보다 면밀하게 평가하기 위해 GD4.5의 자궁에서 조직학적 특성과 marker 유전자 발현을 분석하였다. Sirt1d/d 의 착상 부위는 대조군에 비해 자궁내강 폐쇄가 정상적으로 일어난 Group #1(14/20, 70%)과 비특이적인 Cyclooxygenase 2(COX2) 발현인 Group #26(6/20, 30%)의 두 그룹으로 나눌 수 있었다. 대조군 생쥐의 상피에서 Fork heads box protein O1(FOXO1)은 핵에 정상적으로 국한되었으며, PGR은 기질세포에 제한되었다. 그러나 Sirt1d/d Group #1 의 내강 상피세포에서 세포 핵 내 FOXO1 발현이 유의미하게 감소(세포의 20%)하였고, 세포질 FOXO1 발현이 증가(세포의 80%, p<0.05)하였다. 반정량 H-Scoring 결과는 Sirt1d/d Group #1, #2의 상피 PGR이 대조군에 비해 유의하게 증가함을 보여주었다(p<0.001). 또한 Sirt1d/d Group #2에서 핵 FOXO1 발현을 볼 수 있었으며 정상적인 대조군 상피세포에서는 PGR의 발현이 거의 없지만 Sirt1d/d Group #2의 상피세포에서는 PGR 발현이 강하게 일어난다. GD5.5 시기의 Sirt1d/d 배아착상 영역에서는 두 가지 패턴의 E-cadherin 염색을 보였다. Group #1은 배아를 둘러싼 E-cadherin에 대한 양성 정도가 대조군과 유사했으며. Group #2에서 E-cadherin 양성 상피가 배아를 둘러 싼 형태로 남아있었다. 기질세포의 PGR과 COX2는 Group #1 과 Group #2 Sirt1d/d 배아 영역 모두에서 대조군(p<0.001)에 비해 유의하게 감소했으며, 이는 불완전한 탈락막화를 나타낸다. FOXO1은 자연 조건에서 GD 5.5 착상부위 주변에서 발현되지 않으며, Sirt1d/d Group #1의 결과는 대조군과 유사했다. 그러나 Group #2 착상부위 에서는 상피 세포의 핵에 FOXO1이 양성을 나타냈는데, 이 결과는 Group #2에서 분자 신호 전달이 지연되었음을 나타내고 있다. 인공적으로 유도된 탈피검사에서 Sirt1d/d 암컷은 자궁과 체중비(p<0.05)가 유의하게 감소한 것을 근거로 탈락막화 5일째에 결함을 보였다. 이 발견은 자궁내막 상피의 수용성이 이상이 있음을 나타낸다. 또한 Vimentin과 Elastin을 포함한 중요한 ECM 단백질은 표현형에 차이가 없다. 단, Integrin α1의 식은 GD 4.5 및 5.5에서 Sirt1d/d Group #2에서 이상을 나타낸다. 정상 조건에서 Integrin α1은 배아 부착 부위에서 검출되지 않았으나 Integrin α1은 GD 4.5에서 Sirt1d/d Group #2의 동일한 면적에서 발현을 유지한다. 또한 Sirt1d/d 의 자궁은 ECM의 구조적 결함이 발견되었다. GD 4.5 Sirt1d/d 자궁에서 Collagen에 대한 Picro Sirius Red 염색 결과는 ECM에서 콜라겐 다발이 축적됨을 보여준다. 또한 GD 5.5 Sirt1d/d Group #2는 모든 자궁 세포층에서 콜라겐이 극적으로 감소함을 보여준다. 결과는 SIRT1이 착상 기간 동안 정상적인 ECM 구조를 유지하는데 필요하다는 것을 시사한다. 전체적으로, 이러한 결과들은 SIRT1이 탈락막화에 중요하며 성공적인 착상을 위한 수용성 자궁내막을 준비하는 데 기여한다는 것을 알 수 있다. |Embryo implantation is a complex process between embryo and endometrium. During implantation, the endometrium undergoes histological and functional modification. Extracellular matrix is the key molecules for maintain the microenvironment Also, supporting the embryo implantation and further development of blastocyst. The decidualized tissue provides a permissive, and on the other hand tightly controlled for invading trophoblast. Sirtuin protein (SIRT) family members are SIRT1~7 involves in physiological and various pathological process including neurodegeneration, cancer growth, aging-related defect and also obesity. One of the most critical Sirtuin family member, SIRT1 has well studied past years expecially cancer model. The function of the SIRT1 still controvercial, because it has ability to acting as either suppressor and promoter in growth of the tumor. On the otherwise, SIRT1 was interesting target gene in female reproductive system. Because previous studies evaluated the significant SIRT1 upregulation in human and baboon endometriosis. These results suggest that proper SIRT1 regulation is important for a healthy female reproductive system. However, SIRT1 function in the uterus has not been directly studied. In here, uterine specific Sirt1 null mice using immunohistochemistry analysis, SIRT1 expression throughout early pregnancy in mice and found it to be most strongly expressed at GD4.5 and GD5.5 in decidualized cells and at GD7.5 in secondary decidual cells. 6-month fertility trial revealed that Sirt1d/d females were subfertile, delivering significantly decreased numbers of litters/mouse and pups/litter (n=5, *p<0.05). Without decreased the number of blastocysts collected from Sirt1d/d uteri at GD 3.5 and the levels of progesterone and estrogen were comparable to controls, indicating normal ovarian function. However, implantation site numbers were significantly decreased in Sirt1d/d mice compared to controls at GD5.5 (p <0.05). To more closely assess the cause of the implantation defect, histological characters and marker genes expression were analyzed in the uterus at GD4.5. Sirt1d/d implantation sites could be divided into two groups, Group #1 with luminal closure and non-specific cyclooxygenase 2 (COX2) expression compared to controls (14/20, 70%) and Group #2 with an open lumen and no COX2 (6/20, 30%). In control mice, epithelial forkhead box protein O1 (FOXO1) was localized to the nucleus and PGR was limited to the stroma. In Sirt1d/d Group #1, nuclear FOXO1 expression in luminal epithelial cells was significantly decreased (20% of cells), and cytoplasmic FOXO1 was increased (80% of cells, p<0.05). Semi-quantitative H-score showed that epithelial PGR in Sirt1d/d Group #1 and #2 was significantly increased compared to controls (p<0.001). In Sirt1d/d Group #2, nuclear FOXO1 expression. In epthelium was almost completely absent, and there was strong PGR expression in epithelial cells. At GD5.5, Sirt1d/d embryo areas showed two patterns of E-cadherin staining. Group #1 looked similar to controls with no positive staining for E-cadherin surrounding the embryo. In Group #2 , intact E-cadherin positive epithelium remained surrounding the embryo. Stromal PGR and COX2 were significantly decreased in both Group #1 and Group #2 Sirt1d/d embryo areas compared to controls (p<0.001), indicating defective decidualization. FOXO1 is not expressed around GD 5.5 implantation sites in natural conditions, and Sirt1d/d Group #1 embryo areas were consistent with controls. However, in Group #2 embryo areas, epithelial cells with nuclear FOXO1 are visible, which may indicate delayed molecular signaling in this group. An artificially induced decidualization test revealed that Sirt1d/d females showed defective decidualization at decidualization day 5 based on a significantly decreased uterine weight ratio (p<0.05). This finding is indicative of a non-receptive endometrial epithelium. Also, important ECM protein including Vimentin and Elastin shows no difference between phenotypes. However, the expression of Integrin β1 shows abnormal in Sirt1d/d Group #2 at GD 4.5 and 5.5. In normal conditions, Integrin β1 was not detected in the embryo attachment site but Integrin β1 maintain the expression in same area of Sirt1d/d Group #2 at GD 4.5. In Addition, there is a structural defect of ECM in Sirt1 mice. The result of Masson’s trichrome staining for total collagen in GD 4.5 Sirt1 ablated uterus shows that in epithelial ECM, accumulation of collagen bundle. Also GD 5.5 Sirt1d/d Group #2, shows dramatically decreased collagen in all uterine cell layers. Result suggests that SIRT1 can involve normal ECM structure during the implantation window. Altogether, these data suggest that SIRT1 is important for decidualization and contributes to preparing a receptive endometrium for successful implantation.