In Vitro Developmental Characteristics of Preimplantation Embryos in WBN/Kob Rat

Abstract

Pre-existing diabetes is caused the reduced fertility in female. To solve those problems, the various animal models were used. WBN/Kob is spontaneously develop diabetes in male and it is depend on Quantitative Trait Locus (QTL). However characterization of the preimplantation embryos and the effect QTL genes have not been evaluated in type Ⅱ diabetes mellitus (DM) models including WBN/Kob rat. We hypothesized that a type Ⅱ DM may alter preimplantation embryo’s ability of differentiation, relative to QTL. Litter size of WBN/Kob embryos was significantly smaller than the Wistar embryos without no different in sex ratio. Usually hyperglycemia is a cause of defect in embryo development but WBN/Kob female is not suffering the DM by estrogen. Therefore it is cleared that the decrease of litter size did not result of hyperglycemia. To evaluate the reason, two-cell embryos were harvested from the oviducts and cultured in vitro in mR1ECM medium (rat 1-cell embryo culture medium). We observed developmental rate from 2-cell to blastocyst for 144 hr after hCG injection between Wistar and WBN/Kob. Liter size in WBN/Kob rats (6.2 ± 1.16) was significantly less than Wistar rats (12.1 ± 1.72). The rate of blastocyst development from 2-cell stage was significantly decreased in WBN/Kob embryos compare to Wistar embryos. Developmental retardation was observed between 4-cell and morula stage. However, after morula stage, there was no difference in developmental rate to blastocyst. To evaluate the difference between two groups, the blastomere number was counted using differential staining method. The total cell number was significantly less in WBN/Kob blastocyst than that of the control blastocyst. Also, to know the possibility, whether DM specific QTL genes affect the development of early stage embryos, the expression patterns analyzed using QPCR of a few genes. krt8 gene in WBN/Kob embryo were increased twofold compared to Wistar embryos at 96 hr after hCG injection but decreased at 120 hr and 144 hr after hCG injection. krt18 gene in WBN/Kob embryos was increased twofold compared to Wistar embryos after 96 hr and 120 hr after hCG injection. But at 144 hr after hCG injection, WBN/Kob embryos were decreased compare to Wistar embryos. bex2 gene in two groups was strongly increased at 96 hr after hCG injection and WBN/Kob embryos was smaller than Wistar embryos in this stage. WBN/Kob embryos were increased compared to Wistar embryos at 120 hr after hCG injection but decreased at 144 hr after hCG injection. On summary, the early stage embryo of WBN/Kob was showed developmental delay in vitro. In addition the total number of blastocyst was significantly less than control. On the other hand, DM specific QTL genes expressed in preimplantation stage embryo were showed the different expression patterns from control. Based on that it is suggest that the retardation of early embryonic development and the reduced rate of blastocyst development were caused by genes where are the members of Type Ⅱ DM QTL.|임신율과 착상 후 배 발달의 유지율이 당뇨소견 산모에서 감소되는 것으로 잘 알려져 있다. 이와 같은 문제의 기작을 이해하고 극복하기 위하여 다양한 당뇨 실험동물 모델이 이용되어져 왔다. 이중WBN/Kob 는 자발적으로 당뇨증상이 유발되는 동물 모델로 알려져 있으며 특정Quantitative Trait Locus(QTL)이 당뇨와 관여됨이 밝혀졌다. 따라서 본 연구에서는 자발적 당뇨증상이 있는 WBN/Kob 의 초기 배아의 발생 특성을 분석하였고, QTL에 속한 특정 유전자의 발현 변화와 초기 배아 발생에서 보이는 특성이 관련 되어 있을 가능성을 규명하고자 하였다. WBN/Kob의 한 배 새끼 수는 성비의 차이 없이 통계적으로 유의하게 대조군Wistar에 비해 감소하였다. 암컷 WBN/Kob는 에스트로겐(estrogen)에 의해 당뇨유발이 억제되기 때문에 혈중 포도당 농도가 정상 수준으로 유지된다. 따라서 이러한 새끼 수 감소가 포도당 농도에 의한 것이 아님을 알 수 있다. 이와 관련하여 한 배 새끼 수가 감소한 원인을 초기 배아에서 찾아보고자 2-세포기의 배아를 수란관으로부터 얻고 mR1ECM 배양액에서 체외배양을 하였다. WBN/Kob 2-세포기 배아의 포배 발생율은 대조군에 비하여 유의하게 감소하였고, 2-/ 4-세포기에서 8-세포기로, 8-세포기에서 상실배까지의 발생에서 WBN/Kob 배아의 발생은 각각 지연되었다. 그러나 상실배로 발생한 배아는 대부분 포배로 발생하였다. 두 그룹간의 차이를 분석하고자 배양 96시간 후 포배기로 발달한 배아의 할구 수를 계수하여 그 특성을 분석하였다. 포배기의 할구 수는 WBN/Kob에서 대조군 Wistar에 비해 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 다른 한편으로 체외발생에서 관찰되는 결함이 당뇨의 원인으로 규명된 QTL내 유전자들에 의한 가능성을 알아보고자 배아에서 발현되는 것으로 알려진 krt8, krt18, bex2, elatase1 등의 유전자 발현 변화를 Q-PCR 방법으로 분석하였다. krt8은 2-세포기에 발현하기 시작하여 상실기 단계인 hCG 주사 후 120 시간에 가장 많은 발현 양상을 보였고, 포배로 발생하는 시기인 144시간 이후에는 감소하였다. 그러나 WBN/Kob 배아의 경우 4-/ 8-세포기로 발달한 hCG 주사 후 96시간에 가장 많은 발현을 하였고 이후 급격히 감소하였다. krt18은 4-세포기에 발현하기 시작하여 8세포기에서 상실기 단계인 hCG 주사 후96시간부터 급격한 증가를 하여 120 시간에 가장 많은 발현 양상을 보였다. 이때WBN/Kob에서는 대조군에 비해 발현 양이 증가하는 것을 관찰했고 포배기단계인hCG 주사 후144시간에는 대조군에 비해 감소하는 것을 관찰하였다. 그리고 bex2 는 2-세포기에서 발현하기 시작하여 포배기 단계까지 모두 발현 하였고 8-세포시기인 hCG주사 후 96시간에서 가장 많은 발현 양상을 나타내었다. WBN/Kob에서도 8-세포기인 hCG 주사 후 96시간에 발현 양이 크게 증가하였으나 대조군에 비해서는 2배 이상 적게 발현하였고 상실기 단계인120시간에서는 대조군 보다 높게 발현하였다. 또한 포배기 단계인 hCG후 144시간에서는 WBN/Kob 배아의 발현 양이 Wistar 배아의 발현 양보다 감소하였다. Elastase1은 착상전 시기의 배아에서 모두 발현하지 않았다. 종합해보면 당뇨특이 QTL이 밝혀진 WBN/Kob는 대조군과 비교하여 착상 전 시기의 배아발달이 배아 단계 특이적 현상을 보이며 난할이 지연되나 상실배로 발달한 배아는 대부분 포배로 발생하였다. 그러나 포배를 구성하는 할구의 수는 WBN/Kob에서 유의하게 감소하는 것을 알 수 있었다. 또한 WBN/Kob에서 자발적 2형 당뇨 관련 QTL내 특정 유전자의 발현 양상이 WBN/Kob에서 발달이 지연되는 시기인 hCG 주사 후 72시간에서 120 시간에서 대조군과 현격한 차이를 보였다. 따라서 이러한 결과를 바탕으로 2형 당뇨 관련 QTL내 특정 유전자들이 초기 배아 발생에 영향을 미치는 요인중의 하나가 될 수 있음을 제안한다.