Influence of temperature on the antigenic stability of influenza virus-like particles

Abstract

인플루엔자 바이러스는 유전자 변이를 통해 전 세계에 걸쳐 매년 유행을 초래한다. 인플루엔자는 크게 사망에까지 이르게 할 수도 있어 인류에게 커다란 위협이 된다. 이러한 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하기 위해서는 백신을 접종 받는 것이 가장 효과적인 방법이다. 인플루엔자 바이러스 백신으로는 바이러스 유사 입자 (Virus-like particle, VLP) 가 최근에 주목을 받고 있다. 바이러스 배양 방식으로 기존에 사용해오던 수정란을 통한 배양이 생산 시간과 생산량 등에 한계가 있어 세포를 통해 생산해낼 수 있는 VLP가 새로운 백신 플랫폼으로 떠오르고 있다. VLP는 바이러스와 유사한 구조를 가지고 바이러스의 항원 단백질을 발현하여 면역원성을 이끌어낸다. VLP의 면역원성을 이끌어내는 중요한 부위는 단백질로 구성되어 있는데 단백질은 열에 민감하여 이에 의해 구조적 변화가 일어나는 특징을 가진다. 따라서 이 연구에서는 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) 를 이용하여 VLP를 만들고 항온항습기를 이용하여 VLP를 다양한 온도와 시간 조건으로 열에 노출 시킨 뒤, 그에 따른 VLP의 면역원성을 생체 외(in vitro), 생체 내(in vivo) 실험 방법을 적용하여 확인하였다. 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 생산해 낸 H1N1 PR8 VLP의 발현을 western blot analysis를 통해 확인하였고, 만들어낸 VLP를 항온항습기를 통해 4℃, 25℃, 42℃ 온도에 반응시켰다. 반응이 끝난 VLP의 면역원성 확인을 위해 혈구 응집 반응 (hemagglutination assay, HA assay) 을 실행하였고, 42℃에서 HA titer의 값이 4℃, 25℃에 비해 시간이 지남에 따라 크게 감소함을 확인하였다. 반응 시킨 VLP를 쥐에게 두 차례 접종한 후 채취한 혈액을 통해 효소면역분석법 (enzyme-linked immunospecific assay, ELISA) 를 이용하여 항체 반응을 확인하였고, 야생형 바이러스 공격접종을 통해 백신으로써의 효능을 확인하였다. 4℃와 25℃ 그룹은 모든 시간 조건에 대해 유의미한 수준의 항체가가 유도되었으며, 42℃ 그룹은 시간이 지남에 따라 항체가가 크게 감소하였다. 그러나 2차 접종 후에는 4℃, 25℃, 42℃ 모두 항체가가 크게 향상됨을 보였고 공격접종 후에도 모든 그룹의 쥐가 모두 살아남았다. 이러한 결과를 통해 VLP가 4℃, 25℃, 42℃ 에서 한 달 간 노출 되었을 시 42℃ 에서는 면역원성에 영향을 받음을 확인하였고, 하지만 이러한 시료를 동물에게 두 번 접종했을 때에 충분한 면역원성을 이끌어 낼 수 있음을 확인하였다.|Influenza A virus causes recurrent outbreaks and results in high risk to human. To prevent the infection of influenza, vaccination is the most effective way to control infection of influenza and vaccines have been developed. However, traditional vaccine platforms have several limitations because of egg-based production. To overcome limitations, virus-like particle (VLP) which is cell-based has been promised as an alternative vaccine platform. VLP of influenza virus elicits immune response by viral protein including hemagglutinin, neuraminidase and matrix protein that can be affected by temperature. Therefore, it is needed to identify thermal stability of VLPs for using VLPs as vaccine. In this study, using strain A/Puerto Rico/8/1934 (PR8), influenza H1N1 PR8 VLPs were produced by baculovirus-insect cell expression system. Expression of VLPs was confirmed by western blot analysis. VLPs were exposed to temperature & humidity chamber at 4℃, 25℃, and 42℃. Immunogenicity of VLPs exposed to temperature was confirmed by hemagglutinin (HA) assay. HA titer of 42℃ was significantly decreased as exposed for a long time. BALB/c mice (n=5) were immunized twice with VLPs exposed to temperature and serum was collected by retro-orbital bleeding. IgG response was detected using immunized mice serum by enzyme-linked immunospecific assay (ELISA). After first immunization, IgG response of 42℃ group in month 1 was significantly decreased than 4℃ and 25℃. After second immunization, IgG response of all groups was almost two fold higher or more than first immunization. After lethal virus challenge, all mice survived. These results indicate that when VLPs were exposed to 4℃, 25℃, and 42℃ for a month, significant immunogenicity can be elicited by twice immunization.