Improve the Vitrification Method Suppressing the Disturbance of Microtubule Systems in Matured Oocytes

Abstract

난자의 냉동 보관은 배아 단계가 아닌 새로운 개체로 형성되기 이전의 생식세포 상태이므로, 배아의 보관으로 인한 윤리적, 종교적인 문제를 극복할 수 있으며, 또한 난자 공여 프로그램이나 난자 은행을 가능하게 한다. 최근 여러 연구자들에 난자의 동결 보존을 통한 성공적인 임신을 보고 하고 있으나, 배아 동결 보존 후 임신율에 비하면 성공율이 낮다. 난자의 동결 보존 방법은 배아 동결처럼 완만 동결 방법과 초자화 동결 방법이 있다. 기존의 완만 동결 방법은 난자의 낮은 생존율을 보였으나 초자화 동결법의 적용을 통하여 생존율의 향상을 보였다. 하지만, 초자화 동결로 보관된 난자에서도 해동 후 투명대 경화현상과 미세구조의 손상이 관찰되며 이러한 손상은 동결 보존을 위한 처리단계에 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 효율적인 난자의 냉동 보존 방법을 확립하기 위하여 평형단계에 동결 보존액의 처리 시간에 따른 생존율과 미세소관의 재 회복 정도와 DNA 손상 정도를 보기 위하여 동결 융해 후 생존 난자를 배양한 뒤 spindle과 염색체의 재배열 상태, DNA 손상 정도를 비교, 분석하였다. 본 실험에서 초자화 동결 중 평형 단계에 처리 해준 시간 군은 5분, 10분, 15분 군으로 초자화 동결 후 생존율은 3군 모두에서 높은 생존율을 보여 평형 단계에 처리하는 시간이 생존율에서는 큰 영향을 끼치지 않은 것을 볼 수 있었다. 평형 단계에서 처리 시간에 따른 spindle과 염색체의 재 회복 정도를 보았을 때 평형 시간을 10분 처리하였을 때 정상비율이 가장 높게 나왔다. 대조군과 비교하였을 때 15분을 처리한 군은 유의성 있게 spindle의 비정상 비율이 높게 나왔다. 난자의 DNA 손상은 10분 군에서 가장 적은 손상도를 보였다. 이러한 결과를 통하여 초자화 방법에서 평형단계에서 동결억제제의 노출 시간이 염색체, 방추체 등의 온전성 보존을 통한 난자의 발생능력을 보존하는데 중요한 요인이 됨을 알 수 있다. 그러나 그 정도가 60%를 넘지 못하기 때문에 보다 완결하게 난자를 보존하기 위해서 다방면에서의 추가적 연구가 필요하다. 한편 본 연구 결과는 인간의 난자 동결보존과 사용에 있어서 난자의 발생능력을 보존하는 노력에 있어 세포 수준에서의 여러 가지 정보를 제공하고 있어 이를 응용할 수 있을 것으로 사료된다.|Successful cryopreservation of oocytes would make a significant contribution as an alternative to embryo preservation for various reproductive technologies. Specially, oocyte cryopreservation has the potential to avert many of the ethical, moral, legal and political issues associated with embryo cryopreservation. After the first birth from cryopreserved human oocytes, subsequent births has remained surprisingly low compared with births from cryopreserved embryos. Currently, there are two methods that are used to cryopreserve mammalian oocytes : slow-freezing and vitrification. Vitrification has been widely introduced for cryopreservation of mammalian oocytes and embryos. The meiotic spindle configuration is susceptible to disruption during cryopreservation. This process induces disorganization of the spindle in mature oocytes at this stage and results in disruption of chromosomes, microtubules, and microfilaments. To get the best way for keeping competence of matured oocytes, we studied to get the best conditions for vitrification focused on equilibration times. The mature oocyte were underwent vitrification and analyzed the survival rate, and distribution of microtubules and DNA integrity using both immunostaining and comet assay. The survival rates of recovered oocyte are almost same between groups and are higher than 93%. The structural configuration of meiotic spindle was well kept in 10 min equilibration group and the stability rate was almost same with that of control. Surprisingly the chromosomal breakdown was severe in the recovered oocytes in all experimental groups. However, the chromosomal stability was higher in 10 min equilibration group compared with the other groups. The 10 min equilibration group showed best condition compared with the other groups, but the rate was less than 56%. Therefore, more fine analysis about the effects of physical stress on oocyte during vitrification is needed to define the optimal condition, it is suggested that the optimal equilibration time to get competent oocyte in mouse is 10 min. Based on these results, the equilibration time is one of the key factors in successful keeping for competence of mature oocyte. Information acquired this study with mouse oocyte may provide insight into intracellular structural events occurring in human oocytes after vitrification and application for cryopreservation of human oocyte.