Identification of Bax related genes in the pregnant uterus : roles in Decidualization

Abstract

포유동물에서 자궁내막의 분화는 성공적인 배아의 착상과 모체 보호를 위해 필수적이다. 착상 동안 자궁 기질 세포는 형태적, 기능적인 변화를 겪게 되는데 이러한 과정을 ‘탈락막화’ 라고 한다. 이는 난소호르몬인 에스트로겐과 프로게스테론에 의해서 조절되며, 다양한 전사인자, 형태형성물질, 사이토카인, 세포주기 조절인자에 의해 영향을 받는다. 생쥐의 경우, 임신 5일차에 탈락막 반응이 시작되며 착상중인 배아 주변의 기질세포들이 증식한다. 임신 6일차에 배아 부착 부분과 가까운 기질세포는 세포 증식을 중지하고 1차 탈락막 부위를 형성하게 되며, 이 부분 바깥쪽의 세포는 계속적으로 증식하여 이후 2차 탈락막 부위를 형성하게 된다. 탈락막 세포는 배아의 발달에 필요한 성장인자나 사이토카인을 공급하는 역할을 하며, 발달중인 배아에게 충분한 영양분을 공급하기 위해 모체의 혈관 형성을 돕는다. 탈락막의 퇴화는 성공적인 태반 형성과 배아가 정상적으로 발달할 수 있는 공간 형성을 위해 중요하며, 매우 정교하게 조절되는 과정이다. 탈락막의 퇴화는 세포의 자연사에 의해 진행되며, Bcl-2 계인 Bax 등이 이 과정에서 중요한 조절인자로 알려져 왔다. 그러나 이전의 우리 연구단의 연구에서, 대조군과 비교하여 털색이 검거나(Black Coat, B.C) 또는 흰(White Coat, W.C) Bax 적중 생쥐에서 임신률이나 착상률에는 차이가 없었으나, 출산율은 W.C Bax 적중 생쥐에서 유의하게 낮았다. 이는 Bax 유전자는 탈락막의 퇴화에 직접적인 작용이 없고 Bax 관련 유전자가 탈락막 분화에 작용할 가능성이 있음을 의미한다. 본 연구에서는 세가지 실험군의 임신 7일차의 탈락막을 Microarray 방법을 이용하여 분석하고 정량 real time PCR 방법을 이용하여 대량 분석 방법의 정확성을 증명하였고, 세포 증식과 분화, 자연사, 세포주기와 관련된 많은 수의 유전자들이 유의적인 발현변이를 나타내는 것으로 확인 하였다. 또한 세가지 실험군의 자궁 기질세포를 체외 배양하면서 스테로이드 호르몬을 이용하여 탈락막 반응을 유도한 결과 흰 털색의 Bax 적중 생쥐에서 불완전한 탈락막 반응이 일어남을 확인하였다. 한편 microarray 분석에서 세포 증식과 관련된 c-Myc 관련 유전자들의 유의한 감소가 있어 자궁 기질 세포를 체외 배양하며 탈락막화를 유도하는 동안 c-Myc antagonist를 처리한 결과 탈락막 반응을 억제함을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 흰 털색의 Bax 적중 생쥐는 Bax 및 Bax와 연관된 털색 유전자 (tyrosinase,Tyr) 부위와 눈색 pink-eyed dilution의 상실은 탈락막화 과정에서 관찰되는 세포 증식, 분화, 자연사와 관련된 유전자인 c-Myc과 c-Myc의 하위 유전자 등의 발현을 적절하게 조절하지 못하게 되고 이로 인해 자궁 기질의 탈락막 분화가 정상적으로 일어나지 않음을 추정 할 수 있다.|The process of embryo implantation consists of attachment and invasion of the uterine luminal epithelium. Successful implantation requires the rapid remodeling of the uterine stromal cells in a process termed decidualization. Decidualization is characterized by morphological and functional changes in the uterine stromal cells. This is a complex interplay of transcription factors, morphogens, cytokines, cell cycle regulators and signaling pathways. On day 5 of gestation at the beginning of decidualization, only stromal cells surrounding the implanting blastocyst proliferate. On day 6, the stromal cells in immediate proximity to blastocyst apposition cease to proliferate and form the primary decidual zone (PDZ). And the cells outside the PDZ continue to proliferate and form the secondary decidual zone (SDZ). At the same time with the organogenesis and the growth of embryo, antimesometrial and mesometrial decidua regress by apoptosis and this process is known to be mediated by products of the Bcl-2 gene family. Previous study, we observed that black coat color Bax KO mice are did not difference in pregnancy rate, delivery rate, litter size, implantation rate and decidualization responsibility compare to wild type. But, decidualization responsibility of white coat color Bax KO mice was abnormal. Therefore, in this study, we examined the functional roles of Bax related gene in uterine stromal cell differentiation using Bax knockout mice and in vitro decidual model. A total of 4582 genes were significantly changed at least 2-fold during decidualization in Bax-/-(B.C) compared with Bax+/-. Among these genes, 2439 genes were up-regulated and 2143 genes were down-regulated. A total of 4783 genes were significantly changed at least 2-fold during decidualization in Bax-/-(W.C) compared with Bax+/-. Among these genes, 2381 genes were up-regulated and 2412 genes were down-regulated. A total of 3300 genes were significantly changed at least 2-fold during decidualization in Bax-/-(W.C) compared with Bax-/-(B.C). Among these genes, 1489 genes were up-regulated and 1811 genes were down-regulated. From these results, it is suggested that the large number of genes were changed and is associated with decidualization during early pregnancy. Using in vitro decidualization induction system, antagonist of c-MYC, a candidate of Bax related genes, suppressed the proper decidual reaction. It is suggested that the absence of Bax can’t modulate the expression of c-Myc and the down regulation of c-Myc is the cause of loss the decidual differentiation in the uterine stroma.