Guanosine and its downstream signaling mediate meiotic arrest in mouse oocytes

Abstract

논 문 개 요

포유동물의 난자는 난포 안에서 사춘기까지 제 1차 감수분열 전기의 망상기(dictiate stage)에 머물러있다. 이때의 난자는 난핵포(germinal vesicle)를 특징으로 한다. 배란 직전에 황체형성호르몬(LH)과 같은 성선자극호르몬(gonadotrophin)이 분비되면 난자의 감수분열이 다시 시작되면서 핵막붕괴(germinal vesicle breakdown)가 나타나며 이러한 감수분열의 재개를 난자의 성숙이라고 한다. 따라서 핵막붕괴는 난자성숙의 지표라고 할 수 있다. In vitro에서, 난포로부터 유리된 미성숙 난자가 자발적으로 성숙이 진행되는 것으로 보아 난포에 감수분열을 억제시키는 물질이 있다는 것을 알 수 있다. 또한 유전자변형 생쥐(mouse)를 통한 실험에서 난자가 자체적으로 감수분열 재개 억제를 유지할 수 있는 능력이 있다고 제시되고 있다. cAMP는 가장 대표적인 감수분열 억제를 조절하는 물질이다. cAMP의 농도가 높을 때 활성화된 PKA는 MPF 억제 단백질인 Wee1B, Myt1 kinase를 인산화한다. 이들 kinase는 CDK1의 Thr14, Tyr15잔기를 인산화하며, 이때 같은 잔기를 탈인산화하는 Cdc25B는 PKA에 의해 인산화되어 불활성화 상태가 된다. 인산화된 CDK1은 결과적으로 MPF의 불활성 상태를 유지하게 하고 감수분열 재개를 억제한다. 선행연구에서, 유리된 난자에 아데노신, 구아노신과 같은 퓨린 계열의 분자를 처리하면 감수분열 억제효과가 있음을 밝힌 바 있다. 또한 rat의 brain에서, 구아노신은 세포 표면에서 작용하여 그 효과를 나타내며 cAMP level을 증가시켰다는 연구결과가 보고되었다. 그러나 아직 퓨린계 물질, 특히 구아노신의 난자성숙에서의 작용기작은 잘 알려지지 않았다. 한편, ERK는 난자의 성숙과정에 관여한다고 알려져 있으며, Wee1B kinase에 ERK2가 인산화하는 site가 있다고 보고된 바 있다. 우리 연구실의 선행 data에 의하면, GV 단계의 난자에서 ERK1의 발현이 많고 인산화된 ERK1/2가 확인되었다. 따라서 본 연구에서는 구아노신이 난자 표면에 존재하는 구아노신 수용기와 인산화된 ERK1/2를 통하여 난자성숙을 억제하는가를 알아보고자 하였다. 미성숙 난자는 CD-1 mice (3-4주령)에 5IU의 PMSG를 복강주사하여 난포성장을 유도한 후, 46시간에 난포를 터뜨려 회수하였다. 난자를 둘러싼 과립세포는 pipet을 이용하여 기계적으로 제거하였다. 건강한 난자만을 선택하여 실험에 사용하였다. 난자의 자발적인 성숙을 억제하기 위해 배양액 100ul를 사용하여 난포액의 효과를 보도록 하였다. 유리된 난자에 구아노신 및 구아노신의 길항제를 함께 처리하였는데 GVB가 진행되었다. 한편, 이들은 cAMP level에 영향을 주었는지 경쟁적 효소 면역학적 검정을 진행하였다. ERK1/2의 발현과 인산화된 정도를 western blot을 통해 확인하였다. 그 결과, GV 상태의 난자에서 ERK1/2의 활성이 있으며, 시간에 따른 증감이 있었다. 난포로부터 유리된 난자에 구아노신을 처리한 후 ERK활성 억제제를 미량주사(microinjection)하여 in vitro에서 구아노신에 의한 감수분열의 억제가 ERK를 매개로 한다는 것을 확인하였다. 그 결과, 1pM의 ERK 활성 억제제를 미량주사한 그룹에서 감수분열 재개가 진행됨을 보았다. 또한 난포에 둘러싸인 난자에 ERK 활성 억제제를 미량주사하여 ex vivo에서의 결과를 확인하였다. 이러한 결과를 종합해보면, oolemma에 구아노신 수용기가 있어 이를 통하여 cAMP, ERK 활성을 조절하고 난자성숙을 조절한다고 제안할 수 있다. |Follicle-enclosed oocytes are arrested at first meiotic prophase until puberty in mammals characterized with germinal vesicle (GV). The ovulatory surge of gonadotropins like Luteinizing hormone (LH) triggers resumption of oocyte meiosis. This is defined as the oocyte maturation. GV break down (GVB) indicates the resumption of nuclear maturation in the oocyte. Cumulus originated factors have the ability to inhibit meiotic resumption. In addition, it is suggested that there are some molecules which have the inhibitory effect on meiosis in antral follicles because oocytes of antral follicle underwent oocyte maturation spontaneously in vitro. cAMP is a representative molecule regulating meiotic arrest. When cAMP level is high, protein kinase A (PKA) is activated and phosphorylates its major downstream proteins, Wee1B and Myt1 kinases in mice. Phosphorylated Wee1B/Myt1 phosphorylates Thr14, Tyr15 residues of CDK1. PKA also phosphorylates and inactivates cdc25B which dephosphorylates the same residues of CDK1, thereby inactivating Maturation promoting factor (MPF) and maintaining the meiotic arrest. Meanwhile, it is known that ERK1/2 are required during oocyte maturation after GVB in mice and GVB initiation in Xenopus oocytes. One of the laboratory date (not published) showed that guanosine have inhibitory roles in GVB of follicle free oocytes. It is suggested that some of the effects of extracellular guanosine could be transduced via its specific binding site on cell membrane in rat brain. On the other hand, proteomics analysis suggested that ERK1 level was increased by guanosine treatment. So far, it is not established that the mechanism of purines, especially guanosine during oocyte maturation. To evaluate the signaling molecules which are involved in putative guanosine receptor signaling, cAMP and ERK1/2 were analyzed with western blot, chemicals, and inhibitors. 3-4 weeks old female CD-1 mice were primed with pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) (5 IU). The mice were sacrificed after 46hr of injection and oocytes were collected by ovarian puncture. Cumulus cells were mechanically removed. Guanosine and Gpp[NH]p, its competitive inhibitory molecule, were treated to GV intact oocytes. The high level of ERK1 expression was detected using proteomics analysis, western blot analysis. ERK1/2 levels were high in GV oocytes. Phosphorylated ERK1/2 were detected in GV stage oocytes in antral follicles. Cotreatment of guanosine and Gpp[NH]p released the oocyte from GV arrest. Guanosine increased the level of cAMP after incubation but cotreatment with Gpp[NH]p decreased its levels. Microinjection of the ERK phosphorylation inhibitor caused release from GV arrest by guanosine and antral follicle. It is shown that ERK1 and 2 mediate the meiotic arrest induced by guanosine. Based on these results, it is suggested that guanosine regulates GV arrest through cAMP and ERK1/2, eventually oocyte maturation along with the putative guanosine membrane receptor.