FGFR expression based early embryonic developmental communication

Abstract

섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)는 세포의 증식과 분화 등 여러 가지 세포 활성을 조절하는 성장인자이다. 특히, FGF와 그 수용체를 통한 신호 전달을 통해서 측형성이나 구획(compartmentation)등의 현상을 조절함에 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 많은 연구들을 통해서 밝혀져 왔다. FGF는 22개의 리간드와 조직특이적인 발현 양상을 갖고 리간드 특이적 결합력을 갖는 티로신 인산화효소 수용체가 동정되어 있다. 수용체들은 조직 특이적으로 발현하고 리간드와 복합체를 형성하게 되는데, 헤파린이나 헤파란황산이 이들의 결합을 조절한다고 알려져 있다. 헤파린은 또한 특정 위치의 세포와 직접적인 FGF의 농도 조절에도 관여한다. FGF family 중에서도 FGF-1은 모든 수용체와 높은 결합력을 가지고 있다. 한편 FGF는 치아 줄기세포의 증식 및 미분화 상태 유지, 눈의 발생에서 수정체기원판의 소포로의 분화, 진피유두 유래 FGF들의 모낭줄기세포 활성화, 신경판 유도, 사지싹 형성과 축 형성 등의 배아 발생에서의 역할이 잘 알려져 있다. 한편, 이전 연구에서 PCR 방법을 이용하여 생쥐의 착상 전 배아에서 FGF-1의 mRNA가 발현됨을 밝혔다. FGFR2와 FGFR3 단백질의 mRNA는 착상 전 배아의 특정 난할 단계 특이적으로 mRNA가 발현됨을 그리고 FGFR4 단백질의 mRNA는 착상전 배아의 모든 시기에 발현하고 FGFR1 단백질의 mRNA는 발현하지 않음을 밝혔다. 하지만 이들의 난할과정의 초기 배아 발생에 있어서의 역할은 아직 분명하게 밝혀진 바가 없다. 따라서 이들 FGF의 미수정란부터 포배까지의 시기에 어떤 역할이 있는지를 알아보기 위하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT-PCR)을 이용하여 초기 배아 시기 동안 각각의 mRNA 발현 패턴을 분석하였다. 그리고 FGF-1, FGFR2, FGFR3의 단백질 발현을 알아보기 위해 면역형광법(immune-fluorescence)을 수행하였다. 또한 FGF-1과 그 수용체들의 초기 배아에서의 기능을 분석하기 위해서 재조합 된 FGF-1과 FGFR의 길항제를 각각 농도 별로 처리하여 in vitro에서 배아를 배양하였다. 2-세포기 때 발현되는 양을 기준으로하여 상대적인 발현 정도를 분석하였다. 미수정란과 전핵 시기에서는 FGF-1과 수용체들의 mRNA양이 상대적으로 많았으나 2-세포기 이후에서는 보다 낮은 수치로 발현되었다. FGF-1은 in vivo와 in vitro그룹 모두 8-세포기에 mRNA 발현이 증가하였고, 이후 다시 감소하였다. FGFR2도 FGF-1과 마찬가지로 in vivo와 in vitro 그룹에서 8-세포기에서 높은 발현을 보였고, 4-세포기와 hatching 시기에도 높은 발현양상을 보였다. FGFR2의 1 이형체와 비교해서 2 이형체는 보다 낮은 수치로 발현되었다. FGFR3는 in vitro 그룹에서 상실배와 hatching 시기에 높게 나타났다. 단백질 수준에서는 FGFR2, FGFR3의 단백질은 in vivo와 in vitro 그룹 둘 다 모든 시기에 생쥐 배아에서 검출되었으나, FGF-1은 할구에 위치하지 않았다. FGF-1과 수용체의 초기배아 발생에 있어서의 역할을 확인하기 위해 재조합된 FGF-1과 FGFR의 길항제를 각각 처리하여 배아를 시간대별로 배양하였다. 재조합된 FGF-1를 처리한 경우에는 포배기로의 발생률과 hatching 비율이 증가하였다. FGFR의 길항제를 처리한 실험군에서는 상실배로의 발생률이 농도 의존적으로 유의적인 감소를 보였으나, 이후 시기에는 발생률의 유의적인 변화가 없었다. FGFR 활성 억제로 인한 발생률의 변화가 FGF-1에 의해 회복되는지를 확인하기 위해 FGFR 길항제와 재조합된 FGF-1을 같이 처리한 경우 8-세포기, 포배기로의 발생률 및 부화율 (hatching rate)이 FGFR 길항제 농도 의존적으로 억제되었다. 한편, 난할중인 배아가 수란관을 이동하는 기간에 수란관에서 FGF1이 발현되었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 FGFR 발현은 FGF1의 자가 또는 측분비를 통하여 난할중인 배아의 발생을 조절하는데 관여할 것으로 사료된다.|Fibroblast growth factors (FGF) are involved in several cellular events including cell proliferation, migration and differentiation. In particular, lots of studies suggested that FGF-FGFR signaling pathway is essential for embryo development in mammals including mouse and human. FGFs are identified 22 members and have different affinity with tyrosine kinase FGFR in tissue specific manner. Their receptors formed the complex with FGFs. At this time, heparin or heparan sulfate regulate that FGFs bind to FGFRs. In previous studies, we identified FGF-1 mRNA was expressed in preimplantation mouse embryos. FGFR2 and FGFR3 mRNA were also expressed in specific time. FGFR4 mRNA was expressed in all stage embryos, but FGFR1 mRNA is not detected in early embryo. However, FGFRs functions in early mouse embryos are not cleared. To confirm this, we analyzed the mRNA and protein expression patterns in preimplantation mouse embryos using real-time RT-PCR and immunofluoro-chemistry assay. Maternal FGF and its receptors transcripts were detected with relatively high level. FGF1 mRNA levels were increased at 8-cell stage but after that decreased. FGFR2 and FGFR3 were expressed in all stages mouse embryo. These results are similar to in vitro group. In the case of FGF-1, it was not almost detected in blastomeres. To understand the function of FGF-1 and receptors, we cultured the mouse embryo with recombinant FGF-1 or FGFR antagonist, AZD4547. AZD4547 inhibited embryo development in a concentration dependent manner. Recombinant FGF-1 helps the development. Taken together, it is exposed that FGF-1 and FGFRs are involved in cleavage stage embryo development. In addition, it suggests that FGF-1 may work as auto- and paracrine factor.