Expression of lactate dehydrogenase and aquaporin genes in mouse embryo during preimplantation development

Abstract

착상 전 배아에서의 포배강의 형성은 태반동물의 발생에 있어서 매우 필수적인 과정으로 내세포괴 (ICM)와 영양배엽을 갖는 포배로 분화된다. 포배강 형성은Na^(+)와 Cl^(-)의 유입, K^(+)의 유출, H^(+)의 이동 등으로 생기는 이온의 농도 차이에 의해 형성되는 것으로 알려져 왔다. 그러나 이들 이온 농도차 형성의 원인과 수송 단백질 발현조절에 대한 이해는 미비한 실정이다. 젖산과 관련된 물질대사의 변화가 상실배와 포배시기에 알려져 왔고 연구실 사전 연구 결과에서 젖산이 포배강 형성과 관련되어 있는 것을 가정 할 수 있었다. 따라서 본 실험에서는 젖산 농도에 따른 초기배아 발생 특성분석, 젖산 생성관련 유전자 발현 정도 변화 등을 통하여 젖산이 포배의 발달에 관여함을 밝히고자 하였다. 젖산이 없거나 또는 저농도 젖산을 함유한 배양액에서 2-세포기 이후의 배아가 주어진 시간 내에 (hCG 주사 후 96시간) 포배로 발생하는 율이 유의하게 감소하였다. 젓산 합성 대사 과정에서 중추적 효소인 lactate dehydrogenase (LDH)인 LDHA가 상실배와 포배시기에 발현되고, LDHB와 같은 경우는 난자단계부터 착상 전 모든 단계의 배아에서 발현되었다. LDHC의 경우에는 2세포기와 4세포기에 발현되었다. LDHA, LDHB의 발현은 배양액내 젖산의 농도에 의해 발현양이 조절되었다. 다른 한편 물의 수송과 관련되어 있는 유전자인 AQP유전자 발현양상도 젖산 농도에 의해 발현 변화가 있음이 밝혀졌다. 본 실험에서 보게 된 AQP의 발현양상은 AQP3는 4 세포기와 상실배에 관찰되었으며, AQP8은 부화시기에 발현하였다. 그리고 AQP9 은 4세포기, 8세포기, 포배시기에 발현하였다. AQP3유전자는 젖산이 없는 환경에서 hCG주사 후 120시간의 배아에서 발현되었으며, AQP7은 10mM 젖산 농도에서 hCG 주사 후 120 시간의 배아에서 발현하였다. 그리고 AQP8의 발현은 20mM의 젖산 농도에서 위와 같은 시기에 발현함을 알 수 있었다. AQP9유전자는 비교군 배양액과 10mM 젖산 농도에서 배양한 상실배에서 발현하였다. 위의 실험 결과를 통해서 젖산이 포배 발달에 일정한 역할을 수행하고 있음을 추정 할 수 있다. 또한 배아는 LDH의 발현 조절과 AQP의 발현 조절을 통하여 포배강 형성에 있어서 중요한 조절 요소가 될 수 있음을 알 수 있다.|Differentiation from the morual to blastocyst is under the control of intrinsic and extrinsic regulaiton factors and is a key event in preimplantation embryonic development. Though a few mechanisms have been suggested as a reason for blastocoel formation, it is suspected that there are other mechanisms to control the blastocoel formation. From previous our laboratory results, we can suspect that carbohydrate metabolites may involve in development of morula to blastocyst. In lactate free condition, the 2-cell stage embryos did not properly develop to the blastocyst at 96 hr post hCG injection but there were no defect in development to morula stage at 84 hr post hCG injection. The successful development were concentration dependent and was highest in medium containing 20mM lactate. In natural condition, the embryonic stage at 96 hr post hCG injection is blastocyst. Therefore we know that lactate is need to support the blastocoel formation. Also known that the embryo adaptation to the kinds of carbohydrate substrate. At 120 hr post hCG injection the most of the embryos reach to the blastocyst stage like in control group. In control group, the expression of LDH subunits various according to embryonic stages. LDHA was expressed morula and blastocyst stage, LDHB was expressed oocyte and preimplantation embry, and LDHC was expressed 2cell and 4cell stage embryo. But by the concentration of lactate the expression profiles were changed. LDHA was expressed morula stage in 10mM lactate and blastocyst stage in lactate free condition. LDHB was expressed morula stage in 20mM lactate and morula, blastocyst stage in 10mM lactate and all stage embryos from 120hr post hCG administration at control condition. On the other hand, AQP3 was expressed 4cell and morula stage. AQP8 was expressed hatching stage. AQP9 was expressed 4cell and 8cell and blastocyst stage. But these genes were different expression pattern in related of lactate. AQP3 was expressed all stage embryo in 120hr post hCG administration which was cultured control condition and lactate free condition. AQP7 was expressed all stage embryo in 120hr post hCG administration which was cultured 10mM lactate condition. Also AQP8 was expressed same stage embryo at 20mM lactate condition. AQP9 was expressed morula stage at control and 10mM lactate condition also all stage embryos from 120hr post hCG administration at control condition. Based on them it is suggested that concentration of lactate in environment and lactate synthesis in embryo are critical factor for blastocoels formation. In addition it is suggested that LDH may involve the AQPs expression in embryos. Not only lactate amount in the media and but also lactate production capacity of embryo were associated with blastocoels formation gene, AQPs.