Enhancing the activities of Candida antarctica lipase B by the immobilization on hydroxyapatite and by site directed mutagenesis

Abstract

본 논문은 효소 고정화를 통한 리파제 효소의 반응성 향상에 관한 연구와 효소변이를 통한 반응성 향상에 관한 연구를 다룬다. 먼저 환경친화적인 물질로 알려진 수산화인회석을 담체로 활용한 고정화를 통해 유기 용매 하에서의 리파제 반응성 향상을 수행하였고, 그리고 Candida antarctica lipase B (CAL-B)의 효소변이를 통해 과가수분해 반응성 향상을 수행하였다.

수산화인회석은 사람 뼈의 주성분으로 생체 및 환경친화적인 물질이다. 따라서 수산화인회석은 효소고정화용 담체로서 훌륭한 후보물질로 판단되지만, 현재까지 이에 대한 연구가 활발히 수행되지는 않았다. 본 연구에서는 공유결합을 이용한 리파제 고정화를 시도하였다. 먼저 펩티드결합 물질인 N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N,N'-diisopropyl carbodiimide (DIC) and N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 을 활용하여 리파제를 직접 수산화인회석에 결합하고자 시도하였다. 그런데, 수산화인회석에 리파제를 직접 결합시키면, 많은 양의 단백질이 결합하지 않는다는 것을 확인하였다 (0.26-0.48 mg/g). 이는 아마도 극성의 수산화인회석과 비극성의 리파제 표면들 사이의 반발력에 기인하는 것으로 판단된다. 따라서 이 문제를 해결하기 위해 6-aminohexanoic acid를 연결화합물로 활용하여 리파제와 수산화인회석 사이의 반발력 감소를 시도하였고, 결과적으로 단백질의 결합 양을 대략 5배 정도 향상시킬 수 있었다 (1.70-2.76 mg/g). 그리고 CAL-B의 경우를 포함하여 Burkholderia cepacia lipase (BCL)와 Candida rugosa lipase (CRL)의 고정화된 형태들은, 그렇지 않은 효소형태보다 유기용매 하에서 최대 100배까지 반응성이 증가하였고, 10회의 재사용에도 85% 이상의 반응성이 유지됨을 확인하였다.

CAL-B는 가수분해 효소의 일종이기는 하지만, 과산화수소수를 반응물로 활용한 과가수분해 역시 수행할 수 있음이 알려져 있다. 본 연구에서는 효소변이를 통해 CAL-B의 과가수분해 반응성 향상을 시도하였다. 최근에 CAL-B 가수분해 반응의 반응물인 물분자가 활성자리로 접근하는 통로 존재의 가정이 제안되었다. 본 연구는 이 가정을 기반으로, 과가수분해를 위한 반응물인 과산화수소수 역시 이 통로를 따라 효소 내부로 진입하게 될 것을 가정하였다. 이 가정이 사실이라면, 물통로를 구성하는 아미노산의 변화는 과가수분해 반응성에도 영향을 미칠 수 있을 것으로 기대하였다. 본 연구에서는 분자 모델링을 통해 물통로를 구성하는 아미노산들을 파악하였고, 이들 중 Pro280과 Ala281을 변화대상으로 선정하였다. 선정된 위치에 크기가 다르거나 혹은 보다 극성의 아미노산을 도입시킨 후, 가수분해 반응성과 과가수분해 반응성의 변화를 관찰하였다. Pro280 자리의 변화는 가수분해 또는 과가수분해 반응성의 증가나 감소 정도가 미미하였다. 반면, Ala281의 변이체인 Ala281Ser와 Ala281Thr의 경우, 가수분해 반응성은 각각 2배, 1.2배 가까이 증가하였고, 과가수분해 반응성은 원형 CAL-B의 경우보다 약 2배 정도 향상되는 결과를 확인하였다.|This thesis deals with improving transesterification activity of lipase by immobilization and enhancing the perhydrolase activity by protein engineering. First, lipase was conjugated on hydroxyapatite, which is known as an environmentally-friendly material. Second, Candida antarctica lipase B (CAL-B) was modified by site directed mutagenesis to increase the perhydrolase activity.

Hydroxyapatite as a component of the human bone systems is a biological and environmentally benign substance. Thus, hydroxyapatite is considered an excellent candidate supporting material for enzyme immobilization. However, the application of hydroxyapatite for enzyme immobilization have been rarely reported. In this work, the covalent immobilization of lipase on hydroxyapatite has been achieved. A peptide coupling reagent, such as N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), and N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), was used for direct conjugation of Candida rugosa lipase (CRL) as a model lipase on hydroxyapatite. As CRL was conjugated directly, it was found that CRL was not immobilized sufficiently on hydroxyapatite (0.26-0.48 mg/g). Probably, it is due to a repulsive interaction between the polar surface of hydroxyapatite and the non-polar surface of lipase. To resolve this problem, 6-aminohexanoic acid (6-AmHAc) was used as a linker. The amount of binding lipase on hydroxyapatite increased up to five times using EDC (1.70-2.76 mg/g). Moreover, the activities of the immobilized CRL, CAL-B, and BCL (Burkholderia cepacia lipase) were compared with those of the corresponding free forms. The immobilized lipases exhibited higher activity up to 100 times. In addition, the immobilized lipases maintained up to 85-99% of their activities after ten-time recycling.

It is known that CAL-B catalyzes not only hydrolysis but also perhydrolysis, which is a reaction using hydrogen peroxide as a reactant. In this study, enhancing the perhydrolase activity of CAL-B was achieved by protein engineering. Recently, the existence of the water channel, which the water molecule can enter to the active site, was proposed. Based on this hypothesis, it was assumed that hydrogen peroxide can also enter to the active site through the water channel in perhydrolysis. If it is true, the modification of the amino acids near the water channel possibly affects the perhydrolysis activity of CAL-B. The residues near the water channel were identified by computer modeling. The Pro280 and Ala281 residues were selected as target residue for the modification. After the residues of the channel were replaced with different sized or polar amino acid, the hydrolysis and perhydrolysis activities were compared. There were no significant effects by modifying the Pro280 residue on both activities for hydrolysis and perhydrolysis. In contrast, the hydrolysis activities of the Ala281Ser and Ala281Thr mutant enzymes were 2- and 1.2-fold higher, respectively, and the perhydrolysis activities of them were twice higher compared to that of wild-type enzyme.