Correlation Work between Carbohydrate and Inflammation Factors in Early Embryo Development

Abstract

포유동물에서 수정란의 난할은 수란관을 이동하며 진행되는데 수란관 각 부위의 조건은 각 난할시기배아의 발생 능력을 획득하도록 도와주는 것으로 알려져 있다. 이는 내인성 및 외인성 인자들에 의한 것으로 탄수화물 기질도 그 중의 하나로 제안되어 왔다. 한편, 염증현상과 관련되어 있다고 알려진 prostaglandin-endoperoxide-synthase (PTGS)를 매개로 아라키돈산(arachidonic acid)산물인 PGE2, PGF2a, PGD2, PGI2, 트롬복세인 A2가 착상 전 배아에서 발현된다고 알려져 왔다. 프로스타글란딘 유전자변형동물을 통해 프로스타글란딘이 배란, 수정, 부화(hatching), 착상 등에 관여하고 있음이 제안되었으나 난할 시기 동안의 역할은 밝혀진 바 없다. 초기배아의 물질대사 조건과 적응을 통한 배발생 조절을 위한 유전정보 활용은 포유동물에서 중요하다. 이러한 물질대사 적응현상에서 유전정보 활용의 변화가 수반되는데 일부 조직에서 PTGS매개 산물이 관련되어 있음이 제안되었으나 분명하게 밝혀지지 않았다. 포유동물의 초기 배아는 탄수화물을 이용한 물질대사 능력의 변화가 뚜렷하며 체외에서의 적응현상이 밝혀지고 있다. 따라서 이 연구는 이러한 탄수화물 또는 환경 변화에 적응하는 초기배아발생이 제공되는 탄수화물 종류에 대한 적응과정에서 프로스타글란딘과 관련된 정보가 이용되는 지를 알아보고자 하였다. 배란유도 후 미수정란, 수정란, 2세포기, 4세포기, 8세포기, 상실배, 포배를 얻어, 관련정보의 활용 정도를 확인하였다. 이를 근거로 기본 탄수화물과 특정이온을 함유한 단순배양액 BWW를 이용하여 2세포기를 배양하여 실험하였으며 제한적으로 탄수화물을 제공했을 때 각 관련 정보의 활용 정도를 조사하였다. 정량적 중합효소연쇄반응으로 Ptgs, 프로스타글란딘수용체, 그리고 발생표지인자를 분석하였고, 형광염색을 통하여 단백질의 발현을 분석하였다. Ptgs1의 mRNA양은 1세포기에 가장 많고, 2세포기 때 감소하고, 4세포기에 다시 증가했다. Ptgs2의 mRNA양은 1세포기까지 많게 유지되다가 2세포기에 감소하고, 다시 4세포기에 증가하다가 포배기에 감소를 보였다. 배양액 내의 탄수화물을 달리하였을 때 발생률은 glucose가 없을 때에 hCG 주사 후 72시간, 96시간, 120시간, 140시간에 각각 8세포기이상이 94.34%, 포배율이 49.61%, 후기포배율이 75.72%, 부화율이 70%로 모두 증가하였고, pyruvate와 glucose가 모두 없는 배양액에서는 72시간, 96시간 까지는 각각 8세포기 이상이 93.91%, 상실배율이 80.08%로 발생률이 증가하지만 140시간에는 hatching률이 유의적으로 감소했다. 이를 토대로 각각 다른 배양조건에서 Ptgs1과 Ptgs2의 mRNA 발현양상을 관찰한 결과 glucose가 없는 group에서 4세포기와 8세포기기에 두 가지 모두 발현량이 증가했고, glucose와 pyruvate가 모두 없는 배양조건에서는 8세포기에 두 가지 모두 발현량이 급증했고 hatching시기까지 점차 감소하였다. Ptgfr mRNA의 발현양상이 Ptgs1과 Ptgs2와 유사했으며, Ptgir과 Ptger2는 발현되지 않았다. 이러한 결과를 통하여 배양액 내의 이용할 수 있는 탄수화물 대사산물이 Ptgs 정보 활용 정도를 달리하여 난할시기의 배아에서의 PTGS의 발현 정도를 조절할 것이라고 사료된다.|In mammalian animals, cleavage of fertilized eggs was progressed with migrating trough oviduct. Suitable condition of oviduct support the embryo to gain developmental ability by various factors including endogenous controller and exogenous factors, and carbohydrate was well known regulator. On the other hand, arachidonic acid (AA) metabolites such as PGE2, PGF2a, PGD2, PGI2, and TXA?2 derived from prostaglandin-endoperoxide-synthase (PTGS), known as inflammation factor, are known to expressed in preimplantation embryo. Diverse knockout mouse studies reported the effect of prostaglandin in ovulation, fertilization, hatching and implantation but role of prostaglandin in cleavage stage was not known. Some report proposed that metabolites and inflammation factors have correlation in some tissues, but it is not known clearly. In this study, we tried to investigate whether carbohydrate metabolite regulates the prostaglandin or not in early embryo development. Female CD1 mouse were superovulated and each stage of embryos were collected from oviduct and uterus at specific time for analyze the natural condition embryo’s related information. And we studied using specific carbohydrate conditioned BWW medium for culture of 2-cell embryo and analyzed the data when carbohydrate were restricted. Real time quantitative PCR was performed to Ptgs and receptors of PG, and investigated the protein expression using whole-mount immunofluorescence. Ptgs1 mRNA expression in vivo embryo peaked at 1-cell stage and low at 2-cell stage, and increase at 4-cell stage again. Ptgs2 mRNA expression was high until 1-cell stage, and decreased at 2-cell and increased at 4-cell again, and decreased at blastocyst stage. When restricted the carbohydrate metabolites, development rate of glucose free group increased at 72 hr, 96 hr, 120 hr and 140 hr post hCG. In pyruvate and glucose free group, development rate of 72 hr, 96 hr post hCG increased but decreased from 120 hr to 140 hr post hCG. Ptgs1 and Ptgs2 mRNA expression level of in vitro embryo increased at 4-cell and 8-cell of glucose free group. In pyruvate and glucose free group, Ptgs1 and Ptgs2 mRNA expression rapidly increased at 8-cell stage and gradually decreased to hatching stage. From this result, we suggest the Ptgs have potential role in preimplantation embryo development, and investigated prostaglandin receptor mRNA expression to know what prostaglandin may have role. Ptgfr mRNA expression pattern was similar to both Ptgs1 and Ptgs2 mRNA expression. And Ptgir and Ptger2 mRNA expression were not detected. This result may suggest the potential role of carbohydrate metabolites in PTGS expression regulation and developmental regulation mediating PGF2a.