Characterization of Extracellular matirx protein 1 (ECM1) expression during mouse preimplantation stages in uterus

Abstract

하얀 털 Bax 유전자 제거 생쥐에서 임신 7일 자궁에서 발현하는 유전자를 마이크로어레이 방법을 이용하여 발현 변화가 유의하게 있는 전사체를 찾아 착상과 관련있는 것으로 추정할 수 있는 후보군은 찾았으며, 그 중 하나가 extracellular matrix protein 1 (ECM1)이었다. ECM1은 연골이 뼈로 변화하기 위한 mineralization을 음성조절하여 뼈의 형성을 억제하고, 세포 증식과 혈관생성을 촉진하며, 암 발생시 혈관 주변을 중심으로 발현하는 것으로 알려져왔다. 사람에서 ECM1의 돌연변이는 지질단백증이라는 상염색체 열성 피부 질환의 원인이 된다. 사람의 ECM1은 모든 엑손을 포함한 ECM1a과 선택적 이어맞추기 된 것인 (alternative splicing form) ECM1b, ECM1c, ECM1d의 네 가지로 발현하는데 ECM1a는 대부분의 조직에서 발현되는 것으로 알려져 있으며 특히 혈관이 많이 분포하는 곳에서 높은 발현양을 보인다. ECM1b는 피부 각질층 등에서 나타나며, ECM1c는 표피의 기저막에서, ECM1d는 지질단백증이 있는 사람에게서 발견되었다. 생쥐의 경우, 엑손 전체를 포함하는 ECM1a와 선택적 이어 맞추기 형인 ECM1b가 있는 것으으로 알려져 있다. ECM1이 세포외기질과 연관된 일부 기능이 제안되어 왔으나 세포외 기질의 변화가 왕성한 것으로 알려진 착상시기의 자궁에서의 기능에 대해서는 아직 밝혀진 것이 없다. 따라서 본 연구에서는 ECM1이 uterus에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. ECM1이 착상시기 전후로 어떻게 발현되는지 알기위해 PCR을 통해 mRNA의 발현을 확인하고 ECM1의 splicing form을 확인하기 위해 sequencing을 진행했다. 그 후 Western blot을 통해 단백질의 발현유형을 확인하고, 면역화학염색 방법으로 발현하는 세포와 조직을 확인했다. PCR 결과에서 ECM1은 선택적 이어맞추기 된 것이 발현하는 것을 확인하였으며 이를 각각 그 벤드 크기에 따라 mECM1a, mECM1b, mECM1s라 각각 명명하였다. 염기서열 분석 결과 mECM1a는 기존의 mECM1a, mECM1b는 mECM1b와 일치하였다. 한편 mECM1s는 기존에 밝혀지지 않은 엑손 9, 10, 11로 구성된 새로운 것이었다. mRNA 수준에서 mECM1a, mECM1b의 발현은 1일, 7일에서 확인되고 mECM1s는 실험한 모든 단계에서 발현되었다. IHC결과 ECM1은 착상 이전시기인 1-4일 에는 자궁내막상피, 내막선상피에 표지되었다. 착상이 진행되면서 일차 탈락막과 2차 탈락막 세포의 세포질에 표지되었다. . 이러한 결과를 통하여 임신 초기에 ECM1은 기저수준으로 발현하고 착상이후에 탈락막을 중심으로 발현양이 증가함을 알 수 있었다. 따라서 ECM1에 대한 가능의 자세한 연구는 향후 제작하고자하는 ECM1 conditional knockout 생쥐를 이용하여 확인해야하나, 이전에 알려진 사실과 우리 결과를 바탕으로 ECM1이 착상과 관련된 자궁 분화에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.|Based on previous our studies extracellular matrix protein 1 is suggested as a candidate for an important factors in embryo implantation. In this study, ECM expression was characterized in pregnant mouse uterus. ECM1 mRNA and protein expression were analyzed with PCR and western blot methodology. Its tissue specific expression was analyzed with immunohistochemistry method. In pregnant mouse uterus, there was three splicing forms were expressed and designated in here mECM1a, mECM1b, and mECM1s. mECM1a and mECM1b were same with the ECM1a and ECM1b. Their expression patterns were stage specific.mECM1a and mECM1b were detected in day 1 and day 7. mECM1s was detected in all experimental groups. The profiles of protein levels were similar with that of mRNA. IHC results revealed that it was localized in the decasualized cells after implantation. It was localized in luminal epithelial cell and glandular epithelia cells from day 1 to day 4 of gestation. Though further studies are needed, these results suggested that ECM1 has a role in implantation process with the alternative splicing forms.