Cdk2ap1 regulates Proliferation and Decidual Differentiation of Mouse Stromal Cells during Implantation

Abstract

임신과정 동안 자궁은 착상 위치, 배발생 지원 등을 위한 세포의 증식, 분화, 사멸과 같은 극적인 변화를 겪는다. 이러한 변화에는 ‘탈락막화’ 과정을 포함하는데, 이 과정은 성공적인 배아의 착상과 모체의 보호를 위해 자궁내막이 형태적, 기능적으로 변화하는 것이다. 생쥐의 경우, 착상이 일어나기 전인 임신 3일차까지는 자궁내막의 상피세포가 증식하고, 착상이 일어나기 시작하는 임신 4일차부터는 상피세포의 증식은 멈추고, 기질세포의 증식이 시작된다. 임신 5일차에 탈락막 반응이 시작되며 착상중인 배아 주변의 기질세포들이 활발히 증식한다. 임신 6일차에 배아 부착 부분과 가까운 기질세포는 세포 증식을 멈추고 1차 탈락막 부위를 형성하게 된다. 이후 이 부분은 증식을 멈추고 세포사멸이 일어나는 반면, 그 바깥쪽에 있던 세포는 계속 증식하여 2차 탈락막 부위를 형성하게 된다. 탈락막 세포는 배아 발달에 필요한 성장인자나 사이토카인을 공급하는 역할을 한다. 탈락막의 퇴화는 성공적인 태반 형성과 배아가 정상적으로 발달할 수 있는 공간 형성을 위해 중요하며, 매우 정교하게 조절되는 과정이다. 이러한 기질세포의 탈락막으로의 분화는 여러 요인의 조절 하에 있는데, 그 중 발생과정에서 적절한 수준의 세포 증식이 분화의 기준으로써, 세포 증식의 조절이 탈락막 분화의 중요한 요인으로 여겨질 수 있으나, 아직 그 조절 기작이 잘 밝혀져 있지 않다. Cdk2ap1은 구강상피세포에서 처음 밝혀졌고, 구강암세포 연구를 통해 성장저해인자 기능이 있음이 밝혀졌다. Cdk2ap1은 cdk2의 활성을 억제하여 세포 증식을 저해하는데, 대단위 유전자 발현 연구를 통해 자궁에서도 동정되었다. 따라서, 본 연구에서는 생쥐 배아의 착상기간 동안 자궁에서의 Cdk2ap1 유전자의 발현 양상을 mRNA 수준과 단백질 수준에서 확인하였고, 탈락막 과정과 관련하여 어떠한 기능이 있는지 살펴 보았다. 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR)을 통해 분석한 결과, 임신 1일차의 자궁내막조직에서는 Cdk2ap1 mRNA의 발현 수준이 낮았고, 2일차에서 증가하기 시작하여 5, 6일차까지 높게 유지되었다. 반면 탈락막화 과정의 후반기인 임신 7일차부터 다시 Cdk2ap1 mRNA의 발현 수준이 감소되었고, 태반이 형성되는 12일차에 다시 약간 증가하였다. Cdk2ap1 발현도 임신 시기 동안 관찰된 전사 변화와 유사하게 착상의 시작, 탈락막의 형성과 쇠퇴 양상과 일치하였다. 면역형광법을 통해 Cdk2ap1 단백질의 발현 부위를 시기적으로 관찰한 결과, 착상전인 3일차까지는 기질세포에서 약하게 표지되었고, 착상시기인 4, 5일차에는 기질세포에서 표지되는 양과 범위가 증가하였다. 6일차에는 1차 탈락막 세포에 주로 표지되었고, 7일차에는 2차 탈락막 세포에 주로 표지 되었다. 탈락막이 소실되고 태반이 나타나는 시기에는 태반이 형성되는 부위에 약하게 표지되었다. 체외에서 자궁내막기질세포의 1차세포배양시 E2와 P4를 처리하여 탈락막 반응을 유도하면서, Cdk2ap1 shRNA를 형질주입 했을 경우, 대조군에 비하여 자궁내막세포의 수는 유의하게 증가하였고, 탈락막 세포로 분화하는 비율은 상대적으로 적었다. 반면에 Cdk2ap1 발현 DNA를 형질주입 했을 경우, 대조군에 비하여 자궁내막세포의 수는 유의하게 감소하였고, 탈락막 세포로 분화하는 비율은 크게 증가하였다. 이러한 결과를 바탕으로 탈락막 반응이 진행되는 시기에 Cdk2ap1은 기질세포의 증식을 억제함으로써 기질세포가 탈락막으로 분화하게 하는 요인임을 제안한다.|The uteri undergo dynamic changes such as cellular proliferation, differentiation and apoptosis during pregnancy. These reactions are termed decidualization that is chacterized by morphological and functional changes in uterine stromal cells and is critical to support the implantation. Until 3 days before implantation begins, the endometrial epithelial cells proliferate. At 4 days starting the implantation is to stop the proliferation of epithelial cells, the proliferation of stromal cells begins. Decidual reaction starts in 5 days, and stromal cells surrounding the embryos are actively proliferate. Stromal cells adjacent to the embryo in 6 days stop the proliferation and form the primary decidual zone(PDZ). After the part is to stop the proliferation and apoptosis occurs, but the outer cells to proliferate continuously, to form a secondary decidual zone(SDZ). Eventually the decidual cells undergo apoptosis enlarging the implantation chamber to accommodate the growing embryo. This differentiation of the decidua is subject to the control of many factors. Among them, regulation of cell proliferation may be an important factor in differentiation, but the mechanism is not yet revealed well. Cdk2ap1 is known as growth suppressor identified and isolated from normal keratinocytes. Previous study, we observed that Cdk2ap1 mRNA is highly expressed during proestrus phage and is mainly localized to proliferating tissues. In this study, we profiled the Cdk2ap1 protein expression and localization and examined the functional roles of Cdk2ap1 during implantation. For that real-time PCR technology, Western blotting methodology, immunofluorescence method and in vitro decidualization-induction with transfect technology were employed. The levels of Cdk2ap1 proteins in the pregnant uteri were detected from day 1 of pregnancy but its level is low. At the time of implantation their level was increased until day 7 of pregnancy and then decreased. Cdk2ap1 localized in the stromal cell. Using in vitro primary endometrial stromal cell culture model, the functional role was examined. Cdk2ap1 knock-down suppressed decidual events but Cdk2ap1 overexpression accelerated decidualization. These results show that Cdk2ap1 regulate the stromal cells proliferation on the pregnant stage dependently and differentiation of endometrial cells during implantation.