Aspergullus oryzae mycelium으로부터 분리한 Chitosan과 Chitosan 복합체의 중금속물질의 흡착 및 항진균 효과

Abstract

본 연구는 Aspergillus oryzae mycelium으로부터 chitosan-glucan 복합체와 chitosan을 분리·확인하였고, 분리된 chitosan-glucan 복합체와 chitosan의 물리적 성질을 조사하였으며, 분리된 chitosan-glucan 복합체에 의한 중금속물질의 흡착실험을 실시하여 흡착제로서의 이용 가능성을 검토하였으며, 또한 분리된 chitosan에 의한 식품 중의 곰팜이 생장 억제 능력을 기존에 사용하고 있는 보존제와 비교하여 이들을 천연식품보존제로서 실용화를 위한 적용 가능성을 검토하기 위한 기초자료를 제공하기 위해 수행하였다. A. oryzae mycelium의 성분 분석한 결과 수분 함량은 6.4％, 당류 함량은 42.8％, 단백질 함량은 42.5％, 회분 함량은 4.9％, 지질 함량은 3.4％로 나타났다. A. oryzae mycelium으로부터 분리한 chitosan-glucan 복합체의 중량은 알칼리 농도가 높을수록, 추출시간이 길수록, 추출온도가 높을수록 감소하는 경향인 반면 glucosamine 함량은 증가하였다. 추출된 chitosan-glucan 복합체의 중량과 glucosamine의 함량을 고려할 때 40％ NaOH, 120℃에서 1시간을 최적 추출 조건으로 선정하였다. 또한 알칼리 농도와 온도, 추출시간이 chitosan-glucan 복합체의 중량과 glucosamine의 함량에 미치는 영향을 분산 분석(ANOVA)한 결과 chitosan-glucan 복합체의 중량 감소는 추출 시간만 영향을 받으며, glucosamine 함량 증가는 추출온도에만 영향을 받았다. Chitosan-glucan 복합체에서 chitosan 추출시 chitosan yield와 탈아세틸화도는 acetic acid로 처리한 군이 가장 높게 나타났다. A. oryzae mycelium에 대한 chitosan의 수율은 5.89％(dry basis)로 나타났다. A. oryzae mycelium에서 분리한 chitosan의 IR spectrum은 1655, 1550 cm^(-1)부근에서 amide Ⅰ과 Ⅱ 흡수밴드를 나타내어 chitosan임을 확인하였다. 또한 분리한 chitosan의 점도는 1％ chitosan 용액에서 4cps, 탈아세틸화도는 69％, 평균분자량은 26,600 Da으로 나타났다. A. oryzae mycelium으로부터 분리한 chitosan-glucan 복합체에 의한 중금속물질의 흡착 반응속도론은 반응시간이 경과할수록 증가하는 경향으로 나타났으며, chitosan-glucan 복합체의 흡착 부위에 중금속물질이 쉽게 흡착되어 망간을 제외한 납, 카드뮴, 수은, 아연은 반응 30분이후 부터 흡착평형에 도달하였다. 온도에 따른 흡착 양상은 수은을 제외한 납,카드윰, 망간, 아연은 온도가 증가함에 따라 흡착 제거율이 약간 증가하였다. 온도 변화에 따른 흡착 제거율의 상관 관계는 납인 경우 R^(2)=0.99,카드뮴인 경우 R^(2)=0.85,수은인 경우 R^(2) =0.75, 망간인 경우 R^(2)=0.99, 아연인 경우 R^(2)=0.99로 높은 상관관계를 나타내어 온도 변화가 중금속물질의 흡착률에 영향을 미치는 것으로 확인하였다. pH에 따른 중금속물질의 흡착 제거율은 낮은 pH에서 높은 pH로 갈수록 점점 증가하는 경향을 나타내고 있으며, 또한 chitosan-glucan 복합체 주입량에 따른 흡착 제거율은 양이 증가할수록 증가하는 경향을 나타내고 있다. 중금속물질의 평형농도(Ce)와 chitosan-glucan 복합체 당 중금속물질의 흡착량(X/M)을 Freundlich식에 적용시켜 각 중금속물질의 흡착상수를 구한 결과 날인 경우 1/n은 0.4798, k는 1.896로 등온흡착식은 X/M=1.897 Ce^(0.48)으로 나타났으며, 카드뮴인 경우 1/n은 0.5501, k는2.1809로 등온홉착식은 X/M=2.181 Ce^(0.55)으로 나타났으며, 수은 인 경우 1/n은 0.5564, k는 2.2144로 등온홉착식은 X/M=2.214 Ce^(0.56)으로 나타났으며, 망간인 경우 1/n은 0.4074, k는 1.6963로 등온흡착식은 X/M=1.696 Ce^(0.41)으로 나타났으며, 아연인 경우 1/n은 0.5244, k는 2.0792로 등온흡착식은 X/M=2.079 Ce^(0.52)으로 나타났다. 일반적으로 Freundlich식의 흡착상수 k값은 클수록, 1/n값이 0.3~0.7의 범위내에 포함되는 경우에 흡착이 양호하다고 인정되고 있는데 본 실험에서 1/n이 0.4~0.55로 이 범위안에 포함되므로 모든 중금속물질에서 흡착성이 양호한 것으로 평가되어 chitosan-glucan복합체를 중금속물질을 제거하는 흡착제로서의 적용이 가능하다고 할 수 있다. 분리된 chitosan에 의한 항진균효과를 알아보기 위해 chitosan과 기존에 사용하던 보존제인 소르빈산칼륨과 안식향산나트륨을 첨가한 배지에서 배양한 균체 억제율을 비교해 본 결과 A. oryzae에서는 chitosan 처리구가 다른 두 개의 처리구보다 높은 억제율을 나타낸 반면 R. acidus의 경우는 소르빈산칼륨의 억제율이 가장 높았다. 분리한 chitosan과 소르빈산칼륨용액 농도별에 따른 균체의 억제율은 A. oryzae의 경우 chitosan이 소르빈산칼륨보다 높은 항진균성을 보였으나, R. acidus는 chitosan이 소르빈산칼륨보다 낮은 항진균성을 나타내었다. 또한 분리한 chitosan과 안식향산나트룹용액 농도별에 따른 균체의 억제율은 A. oryzae와 R. acidus의 경우 chitosan과 안식향산 나트륨 첨가군 모두에서 농도가 증가할수록 저하되는 양상을 보였으며 chitosan인 경우 1 mg/ml일 때 양 군 모두 50％ 이상의 억제율을 보였다. A. oryzae, R. acidus에 대한 키토산, 소르빈산칼륨, 안식향산나트륨 첨가량과 실험균의 발육억제와의 상관관계는 chitosan인 경우 각각 R^(2)=0.9481과 R^(2)=0.7449, 소르빈산칼륨인 경우 R^(2)=0.9748과 R^(2)= 0.7605, 안식향산나트륨인 경우 R^(2)=0.9519과 R^(2)=0.7017로 농도 변화에 따른 균체의 발육에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 따라서 생물 산업에 이용된 후 버려지는 A. oryzae mycelium의 폐기물은 chitosan?? chitosan-glucan 복합체의 잠재적인 원료로서 가능할 것이며, 생물산업에 이용된 후 버려지는 균사체 페기물을 보다 부가가치를 높은 고품위의 제품으로 즉 흡착제 및 천연식품보존제로 재사용하기 위한 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.|Chitosan was isolated from A. oryzae mycelium. This can be the potential resource for the production of chitosan and chitosan-glucan complex. The chitosan and chitosan-glucan complex was qualitatively identified by IR spectrum. The rheological properties of the chitosan solutions were examined. The compositon of A. oryzae mycelium has been investigated. The chemical analysis of A. oryzae mycelium was consists chiefly of carbohydrate(42.8％) and protein(42.5％), with smaller amounts of moisture (6.4％), ash(4.9％) and crude fat(3.4％). In the case of isolating of chitosan from A. oryzae mycelium, hot alkali extraction(40％ NaOH, 120℃, 1hr.) was carried out to remove alkali soluble glucan, protein and lipid. This was followed by acetic acid extraction (0.5 N acetic acid, 95 ℃, 12hr.) to extract the chitosan. To isolated chitosan from A. oryzae mycelium and the affect of the yield of chitosan-glucan complex and glucosamine, the alkaline concentration, the temperature, and the extraction time were examined by ANOVA test. At the 5％ significant level, the yield of chitosan-glucan complex was only affected by the extraction time while the glucosamine content was affected by the temperature. The yield of chitosan and chitosan-glucan complex were 5.89％ (dry basis) and 20.73％(dry basis) of homogenized A. oryzae mycelium, respectively. The IR spectrum of the chitosan and chitosan-glucan complex showed that they had specific absorption band of chitosan at 1665 and 1550 cm^(-1). Also, the peak pattern was very similar. The degree of deacetylation of chitosan was 69.0％ as determined IR spectroscopy, and the viscosity was 4, 12, 52 and 1,000 cps in 1％, 2.5％, 5％ and 10％, respectively. Therefore, the viscosity of chitosan were increased according to the concentration. The weight-average molecular weight by GPC was 26,600Da. The removal efficiency of heavy metals by chitosan-glucan complex isolated from A. oryzae mycelium was investigated through laboratory experiments. In the adsorption study, the influence of adsorption kinetics and adsorption isotherm and various parameter such as pH, temperature, adsorbent amount was investigated. The results of the study are as follows. The adsorption kinetics of heavy metals were reached the equilibrium adsorption in approximately 30 minutes and the removal efficiency were showed 79.9％~97.4％. The effect of temperature on heavy metals adsorption by chitosan-glucan complex shows that as the temperature increased, the amount of heavy metals adsorption per unit weight of chitosan-glucan complex increased. But the effect was minor. The correlation between amount of heavy metals adsorption per unit weight of chitosan-glucan complex and temper-ature were obtained through the coefficient of determination(R^(2)). R^(2) values were 0.99(p＜0.05), 0.85(p＜0.05), 0.75(p＜0.05), 0.99(p＜0.05) and 0.98(p＜0.05) in Pb, Hg, Cd, Mn, and Zn, respectively. The removal efficiency was slightly increased with increaseing pH. The effect of pH on heavy metals by chitosan-glucan complex show that at a pH 4, only 6.5％, 4.8％ and 4.5％ of the Cd, Mn, and Zn was absorbed, respectively, and 40％ of Pb, 85％ of Hg was removed. The injected chitosan-glucan complex in which 0.1 g was adsorpted highly and the removal of heavy metals was found to have the best removal efficiency. A linearized Freundlich equation was used to fit the acquired experimental data. As a result, Freundlich constants, the adsorption intensity(1/n) was 0.4798, 0.5501, 0.5564, 0.4074, 0.5244 on the Pb, Cd, Hg, Mn, Zn, respectively. And the measure of adsorption(k) was 1.8967, 2.1809, 2.2144, 1.6963, 2.0792 on the Pb, Cd, Hg, Mn, Zn, respectively. So, it was concluded that adsorption of heavy metals by chitosan-glucan complex is effective. This study was performed to investigate the antifungal ability of chitosan which is extracted from A. oryzae mycelium compared with that of sodium benzoate, potassium sorbate which is artificial food additive. The fungi used to this study were A. oryzae and R. acidus and both of them incubate at 30℃ for 72 hours. The growth of A. oryzae in chitosan treatment was increased 63.5％ compared with the control, 33.6％ in the sodium benzoate treatment, 51.4％ in the potassium sorbate treatment. It is shown that the decrease rate of A. oryzae was remarkly decreased in chitosan treatment. The growth of R. acidus in chitosan treatment was decreased 57.3％ compared with the control, 80.2％ in the sodium benzoate treatment, 88.7％ in the potassium sorbate treatment. In is shown that the decrease rate of R. acidus was remarkly decreased potassium sorbate. The inhibition rate of chitosan and sodium benzoate in A. oryzae was 33.7％ and 21.5％ at 0.5 mg/ml compared with the control, 63.5％ and 33.6％ at 1 mg/ml, 92.9％ and 45.9％ at 5 mg/ml. The inhibition rate of chitosan and sodium benzoate in R. acidus was 34.8％ and 39.3％ at 0.5 mg/ml compared with the control, 57.3％ and 80.2％ at 1 mg/ml, 89.9％ and 89.3％ at 5 mg/ml. The inhibition rate of chitosan and potassium sorbate in A. oryzae was 33.7％ and 26.5％ at 0.5 mg/ml compared with the control, 63.5％ and 51.4％ at 1 mg/ml, 92.9％ and 82.8％ at 5 mg/ml. The inhibition rate of chitosan and potassium sorbate in R. acidus was 34.8％ and 57.7％ at 0.5 mg/ml compared with the control, 57.3％ and 88.7％ at 1 mg/ml, 89.9％ and 98.8％ at 5 mg/ ml. The correlation between chitosan, sodium benzoate and potassium sorbate in A. oryzae were obtained through the coefficient of deter-mination(R^(2)). R^(2) vlues were 0.9481, 0.9748, and 0.9519 in the chitosan, sodium benzoate, and potassium sorbate treatment, respectively. The correlation between chitosan, sodium benzoate and porassium sorbate in R. acidus were obtained through the coefficient of determi -nation(R^(2)). R^(2) vlues were 0.7449, 0.7605, and 0.7017 in the chitosan, sodium benzoate, and potassium sorbate treatment, respectively.