Alternative Splicing of Yes-associated protein and its roles during implantation

Abstract

Decidualization is a vital process in early pregnancy, during which endometrial stromal cells undergo differentiation to support embryo implantation and facilitate developmental signaling. The Hippo signaling pathway, a serine/threonine kinase cascade that regulates cell proliferation, survival, and apoptosis, is recognized as a critical factor in both normal development and pathological progression. In this study, we examined the role of YAP1, the primary effector of the Hippo signaling pathway, in regulating decidualization during early pregnancy. Western blot analysis of YAP1, its target gene CTGF, and the TEAD family transcription factors that interact with YAP1 demonstrated an increase in the expression of YAP1, CTGF, and TEAD1 as decidualization progressed. Immunohistochemical analysis was performed from day 1 to day 7 of pregnancy to observe dynamic changes in YAP1 localization, which corresponded to physiological status. Western blot analysis identified four distinct bands corresponding to alternative splicing isoforms of YAP1, with a significant increase observed on day 7 of pregnancy, which correlated with an increase in uterine size and weight. In addition, higher expression of YAP1 was observed at the implantation site compared to the inter-implantation site. Subsequent analysis of post-translational modifications (PTMs) revealed that the 60 kDa band corresponded to the glycosylated form of YAP1. Further investigation using the O-GlcNAcAtlas 3.0 program confirmed that O-GlcNAcylation of mouse YAP1 occurs at serine 94, consistent with its human counterpart. This suggests that O-GlcNAcylation may play a regulatory role in YAP1’s function as a transcriptional co-activator. Furthermore, Western blot analysis of O-GlcNAcylated proteins in the uterus of early pregnant mice revealed a gradual increase in O-GlcNAcylation levels from day 1 to day 7 of pregnancy. Co-immunoprecipitation (Co-IP) analysis confirmed that YAP1, represented by the 52 kDa and 28 kDa bands, interacts with O-GlcNAc. Collectively, these findings demonstrate that YAP1 plays a critical role in cell proliferation and differentiation in the early pregnant uterus and may regulate its physiological functions.|Decidualization은 초기 임신 과정에서 배아 착상과 발달을 지원하기 위해 자궁 내막 기질 세포가 분화하는 중요한 과정입니다. Hippo signaling pathway는 세포 증식, 생존 및 세포 자살에 관여하는 serine/threonine kinase 신호 전달 경로로, 발생 과정과 암 진행에서 중요한 역할을 하는 인자로 인식되고 있습니다. 본 연구에서는 Hippo signaling pathway의 주요 효과자인 YAP1이 초기 임신 중 decidualization에서 어떤 역할을 하는지 조사하였습니다. YAP1, 그 타겟 유전자 CTGF, 그리고 YAP1과 상호작용하는 TEAD 전사인자들에 대한 웨스턴 블롯 분석을 통해 YAP1, CTGF, TEAD1의 발현이 decidualization이 진행됨에 따라 증가하는 것을 확인했습니다. 면역조직화학적 분석에서는 임신 1일차부터 7일차까지 decidualization 진행에 따라 YAP1의 국소화가 동적으로 변화하는 것을 확인할 수 있었습니다. 또한, 웨스턴 블롯 분석에서 YAP1의 alternative splicing form에 해당하는 네 개의 뚜렷한 밴드를 확인하였고, 임신 7일차에서 발현이 유의미하게 증가했으며, 이는 자궁 크기와 무게의 증가와 상관관계를 보였습니다. 또한, 착상 부위에서 비착상 부위보다 YAP1의 발현이 더 높게 나타나 YAP1이 착상에 중요한 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었습니다. 후속 실험을 통해 YAP1의 post-translational modifications(PTMs)에 미치는 영향을 조사한 결과, 60 kDa 밴드가 당화된 YAP1에 해당하는 것으로 나타났습니다. 추가적으로, O-GlcNAcAtlas 3.0 프로그램을 사용하여 마우스 YAP1의 O-GlcNAcylation이 94번 세린에서 일어난다는 사실을 확인했으며, 이는 인간 YAP1과 유사한 양상으로 YAP1의 전사 공동활성화 기능을 조절할 수 있음을 시사합니다. 또한 임신 초기 마우스의 자궁에서 O-GlcNAcylation 된 단백질의 수준을 western blot을 통해 확인하였을 때 임신 1일차에서 7일차까지 점진적으로 증가하는 경향을 보였고, co-IP 분석 결과를 통해 52kDa과 28kDa의 YAP1에 O-GlcNAc에 결합함을 확인하였습니다. 본 연구는 YAP1이 초기 임신 자궁에서 세포 증식과 분화에 중요한 역할을 하며, O-GlcNAcylation과 같은 PTM이 YAP1의 기능을 조절할 수 있음을 제시합니다.